肉牛MSTN基因miRNA干扰载体的构建及干扰效果验证

郑艳玲，郑月茂，姜八一，王勇胜，张 涌*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.山东畜牧兽医职业学院,山东潍坊 261061)

产肉量是肉畜的主要经济性状，它一向是畜牧业育种和饲养管理的主要目标之一。1997年，美国John Hopkins大学的McPherron等[1]研究发现肌肉生成抑制素(myostatin，MSTN)是骨骼肌生长发育的负调控因子，其活性的丧失，会引起动物肌肉的过度发育，肌纤维直径变大或肌纤维数增加，表现为动物的“双肌”性状。在自然界中存在MSTN基因突变导致的比利时蓝牛、皮特蒙特牛及特克赛尔绵羊的双肌表型。对牛的研究表明，双肌性状可以使牛在相同的饲喂条件下肌肉产量增加20%～30%，双肌牛的肉骨比比普通牛高30%，双肌肉有较好的肉质，且脂肪率低，口感良好。因此，通过对MSTN基因的突变、缺失、敲除及基因沉默等遗传修饰，获得转基因克隆动物，可以达到提高家畜肌肉重量的目的，生产具有商业化价值的优良品种家畜。本研究根据牛的MSTN基因序列设计并合成4对针对MSTNCDS区的miRNA寡聚单链DNA序列，将其连入miRNA表达载体中，构建得到了能够有效对MSTNmRNA合成和蛋白表达进行干扰的载体，为后续通过miRNA干扰敲减肉牛MSTN基因的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体、菌株和细胞 BLOCK-iTTMPol Ⅱ miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP (K4936-00)载体构建试剂盒，Invitrogen生物技术有限公司产品；DH5α菌株为实验室保存；秦川肉牛胎儿骨骼肌卫星细胞为实验室保存细胞。

1.1.2 主要试剂SalⅠ、1 kb DNA Ladder，MBI公司产品；Trizol，Invitrogen公司产品；反转录试剂盒与SYBR®Premix ExTaqTMⅡ (Perfect Real Time)，大连宝生物公司产品；胎牛血清，GIBCO公司产品；Ham’s F-10液体培养基，Sigma公司产品；一抗MSTN多克隆抗体，Millopore公司产品；细胞转染试剂Fugene HD，Roche公司产品。

1.1.3 主要仪器 凝胶成像分析系统(GDS8000)，美国UVP公司产品；荧光定量PCR仪(7500)，美国ABI公司产品；荧光相差倒置显微镜(TE2000)，日本NIKON公司产品。

1.2 方法

1.2.1 miRNA寡聚单链DNA序列的合成 根据牛MSTN基因序列 (序列号AY160688)，应用Invitrogen公司的在线设计软件Invitrogen’s RNAi Designer设计4对miRNA寡聚单链DNA序列及1对无效序列(阴性对照)，交由上海英骏生物公司进行合成，序列见表1。

表1 miRNA寡聚单链DNA序列(附阴性对照序列)Table 1 miRNA single-stranded oligo DNA sequences (with the negative control sequence)

1.2.2MSTN基因miRNA干扰载体的构建 将4对靶向MSTN的寡聚单链DNA序列及1对阴性对照退火后形成双链，然后用载体构建试剂盒BLOCK-iTTMPol Ⅱ miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP进行重组，将5对双链的miRNA oligo分别插入到miRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR中，从而构建5个miRNA干扰载体，分别命名为miR-MSTN-1、miR-MSTN-2、miR-MSTN-3、miR-MSTN-4及miR-Neg，干扰载体的总长度为5 763 bp。

1.2.3 有效干扰载体的筛选

1.2.3.1 肉牛骨骼肌卫星细胞的复苏和培养 将冻存的原代秦川肉牛胎儿骨骼肌卫星细胞在37℃水浴中解冻，接种在60 mm细胞培养皿中，用含15%胎牛血清的Ham’s F-10对细胞进行培养。

1.2.3.2 细胞的瞬时转染 当细胞生长至80%汇合时，将细胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化，按5×105细胞/皿将骨骼肌卫星细胞接种于含15%FBS的Ham’s F-10培养液的6孔板上。当骨骼肌卫星细胞生长达到50%～60%汇合时，用脂质体FugeneHD将MSTN基因miRNA干扰载体miR-MSTN-1、miR-MSTN-2、miR-MSTN-3、miR-MSTN-4及阴性对照干扰载体miR-Neg转染骨骼肌卫星细胞，未转染细胞作为空白对照。

1.2.3.3 荧光显微镜观察转染效率 利用荧光显微镜观察干扰载体转染48 h后的细胞。选择最大激发波长为488 nm，最大发射波长为507 nm。

1.2.3.4 实时荧光定量PCR法检测MSTNmRNA的表达 用Trizol从1组未转染组(空白对照组)细胞和5组转染细胞(试验组)中分别提取细胞总RNA，反转录成cDNA，实时荧光定量PCR法分析各组MSTN基因相对表达水平，β-actin作为内参基因，定量数据用2-△△Ct的方法分析。PCR引物序列见表2。

表2 实时荧光定量PCR引物信息Table 2 Primer information for real-time quantitative PCR

1.2.3.5 Western blot检测MSTN蛋白表达 从未转染组和试验组胎儿骨骼肌卫星细胞中提取全蛋白进行MSTN蛋白表达的检测，用MSTN多克隆抗体作为一抗，MSTN一抗稀释倍数为1∶3 000；β-actin作为内参蛋白。

1.2.4 数据统计分析 采用SPSS 26软件进行统计学分析。组间比较采用T检验，P<0.05表明差异具有统计学意义，P<0.01表明差异极显著。

2 结果

2.1 干扰载体构建结果

本试验设计了4对针对MSTN基因CDS区4个不同区域的miRNA寡聚单链DNA序列及1对阴性对照序列，并构建了miRNA干扰载体，分别命名为miR-MSTN-1、miR-MSTN-2、miR-MSTN-3、miR-MSTN-4和miR-MSTN-Neg。miR-MSTN-1、miR-MSTN-2、miR-MSTN-3、miR-MSTN-4和miR-MSTN-Neg经载体上的单酶切位点SalⅠ酶切后均得到1条5 763 bp的条带(图1)，说明载体构建正确。

M.DNA标准；1.miR-Neg；2.miR-MSTN-1；3.miR-MSTN-2；4.miR-MSTN-3；5.miR-MSTN-4M.DNA Marker;1.miR-Neg;2.miR-MSTN-1;3.miR-MSTN-2;4.miR-MSTN-3;5.miR-MSTN-4图1 miRNA干扰载体SalⅠ酶切鉴定结果Fig.1 Identification of miRNA expression vectors with SalⅠ

2.2 细胞转染结果

用4个干扰载体与1个阴性对照载体转染骨骼肌卫星细胞24 h后，在荧光显微镜下观察，干扰载体转染组细胞发绿色荧光，48 h后80%以上的细胞中有EmGFP表达，而未转染组没有检测到EmGFP的表达，说明转染成功(图2)。

A、A0.未转染组；B、B0.miR-Neg转染组；C、C0.miR-MSTN-1转染组；D、D0.miR-MSTN-2转染组；E、E0.miR-MSTN-3转染组；F、F0.miR-MSTN-4转染组；A、B、C、D、E、F.光学显微镜下观察；A0、B0、C0、D0、E0、F0.荧光显微镜下观察A,A0.Untransfected group;B,B0.miR-Neg group.C,C0.miR-MSTN-1 group;D,D0.miR-MSTN-2 group;E,E0.miR-MSTN-3 group;F,F0.miR-MSTN-4 group;A,B,C,D,E,F.Cells observed under light microscope;A0,B0,C0,D0,E0,F0.Cells observed under fluorescent microscope.图2 未转染组及转染组转染48 h后细胞观察结果(×200，标尺代表50 μm)Fig.2 The result of untransfected cells and transfected cells observed under the fluorescence microscope after 48 h post-transfection (×200,the scale bars indicate 50 μm)

2.3 实时荧光定量PCR法检测MSTN mRNA的表达结果

在转染肉牛骨骼肌卫星细胞48 h 后，实时荧光定量PCR检测发现，miR-MSTN-1、miR-MSTN-2、miR-MSTN-3、miR-MSTN-4 4个试验组均有效抑制了MSTN基因mRNA的表达。MSTNmiRNA干扰载体转染组与未转染组相比MSTNmRNA的相对表达量为52.6%、47.4%、50.9%和26.3%，差异均极显著(P<0.01)，而阴性对照组与未转染组相比相对表达量为91.2%，差异不显著(P>0.05)，通过计算得到4个miR-MSTN转染组干扰效率分别为47.4%、52.6%、49.1%和73.7%(图3)。

1.未转染组；2.miR-Neg转染组；3.miR-MSTN-1转染组；4.miR-MSTN-2转染组；5.miR-MSTN-3转染组；6.miR-MSTN-4转染组；a.P<0.011.Untransfected group;2.miR-Neg group;3.miR-MSTN-1 group;4.miR-MSTN-2 group;5.miR-MSTN-3 group;6.miR-MSTN-4 group;a.P<0.01图3 miRNA干扰载体对MSTN表达的影响Fig.3 Effect of miRNA interference vectors on MSTN expression

2.4 Western blot检测MSTN蛋白表达

Western blot进一步检测MSTN蛋白表达量发现，4个MSTN干扰组MSTN蛋白水平与对照组相比明显下降，其中miR-MSTN-4组与阴性对照组及未转染组相比蛋白表达量均少于其他3个组(图4)。

1.未转染组；2.miR-Neg转染组；3.miR-MSTN-1转染组；4.miR-MSTN-2转染组；5.miR-MSTN-3转染组；6.miR-MSTN-4转染组

3 讨论

MSTN会抑制动物的肌肉生长和发育，当MSTN基因在某些条件下缺失或突变时，会导致动物肌肉肥大，这对提高动物肌肉产量是极其有益的，因此，不断有科研人员开展敲减动物体内MSTN基因的研究。在畜牧业上，已有很多研究利用基因敲除技术获得了MSTN基因缺失的动物[2-4]。

MSTN基因是动物体内正常表达的一个基因，它不仅仅在骨骼肌中表达，在很多动物的心肌、乳腺组织等均有表达[5-6]。双肌牛具有的繁殖力下降、难产率增加、成活率低及患有呼吸道疾病等缺点，可能都是由于MSTN基因的非骨骼肌特异性表达引起的，MSTN敲除或抑制以后影响了其在非骨骼肌组织器官参与的正常生理过程。利用组织特异性基因敲除或组织特异性RNA干扰的方法对MSTN基因进行组织特异性基因沉默为动物育种开辟了一条新的途径，具有很好的发展前景，目前还没有见到利用组织特异性敲减MSTN的报道。

pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体中CMV 启动子可由高效的RNA聚合酶Ⅲ或具有聚合酶Ⅱ启动子启动的单顺反子甚至多顺反子转录，这可允许组织特异性表达系统和条件性表达系统的使用[7]，从而能够达到组织特异性干扰的目的。其中还含有形成miRNA前体物必需的5＇和3＇miR 侧翼区，借鉴了miRNA的左右翼序列，相对于普通的shRNA，更易形成成熟的干扰RNA，表达水平更高，干扰效率也更强[8]，因此，本试验选用pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR用于干扰载体的构建。构建的载体中含有报告基因EmGFP进行共转染，这有利于追踪转染的细胞，可对其转染效率进行观察。

本试验针对MSTN基因的外显子区设计的4对miRNA寡聚单链DNA序列，通过试验证明其对骨骼肌卫星细胞MSTNmRNA及蛋白的表达都有一定的沉默作用，而包含第4对片段miR-MSTN-4干扰效果最好，对MSTNmRNA表达的干扰效率达到70%以上，这可能与第4对片段是针对MSTN基因编码活性区保守性最高的第3外显子设计有关。本研究为后续利用miRNA干扰MSTN转基因肉牛的研究奠定了基础。