2019年-2021年密云地区呼吸道疾病病死牛支原体的分离鉴定

张美晶

(北京市密云区动物疫病预防控制中心，北京密云区 101500)

支原体(Mycoplasma)是广泛存在于自然界中能自我复制的原核微生物，可以引起禽类、哺乳动物及人类的呼吸系统、生殖系统疾病及关节炎、乳腺炎及眼炎等疾病，已成为临床中常见的危害多种动物的病原体[1-2]。牛支原体病在世界各地均有流行，其中20多种支原体可感染不同日龄的牛，且感染率和病死率均较高，给牛养殖业造成严重的经济损失[3-4]。牛支原体可引起不同日龄牛的肺炎、关节炎、乳房炎、流产及生殖器感染等一系列疾病，犊牛以肺炎、中耳炎、关节炎为主，母牛以乳房炎为主[5-6]。1983年我国首次报道从患乳房炎奶牛中分离得到支原体[7]，后相继又从呼吸道疾病死亡的肉牛和犊牛肺脏中分离到牛支原体。临床中牛以发热、咳嗽和流鼻涕为主要症状，严重的可以导致坏死性肺炎，被确诊为牛支原体感染所致的牛支原体肺炎。支原体肺炎已成为引起牛呼吸系统疾病的主要病原之一，且在多个国家和地区流行，严重危害牛的健康[7-10]。临床中支原体感染主要通过抗生素防控，由于支原体缺乏细胞壁结构，对广谱抗生素不敏感，且随着抗生素的使用，其耐药性越来越严重，耐药菌株逐渐增多，严重影响治疗效果[11]。

本研究对2019年-2021年从密云地区规模化牛养殖场采集1 294份(每份血清对应每份病料组织)疑似支原体感染病料组织进行支原体感染情况检测，并对检测阳性的样品进行支原体菌株分离鉴定和分离菌株的耐药性分析，以期为该地区牛养殖场支原体临床合理用药及防控提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 2019年-2021年，采集密云地区规模化牛养殖场中出现呼吸道疾病病死牛的样品，病牛主要表现为呼吸困难、采食量减少，尤其是9月份以后发病严重，以调运的肉牛发病为主，发病率在45%以上，病死率20%。共采集病死牛(肉牛及奶牛)的血清及肺脏等病料组织共计1 294份(每份血清对应每份病料组织)，其中2019年采集 421份、2020年采集433份、2021年 采集440份。

1.1.2 主要试剂 牛支原体ELISA抗体检测试剂盒，购自比利时Bio-X公司；PPLO琼脂培养基、PPLO液体培养基、改良Frey液体培养基，均购自广东环凯微生物科技有限公司；DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒，均购自北京索莱宝科技有限公司；抗支原体类药物药敏纸片，购自北京天坛药物生物技术开发公司；细菌微量生化鉴定管，购自海博生物技术有限公司；DL 2000 Maker，2×TaqMaster Mix，购自宝生物生物(大连)有限公司。

1.1.3 主要仪器 双人超净工作台，博科(BIOBASE)公司产品；恒温培养箱，芜湖华测仪器设备有限公司产品；小型离心机、多功能PCR仪、凝胶成像仪，ThermoFisher公司产品。

1.2 方法

1.2.1 牛支原体感染检测 采用牛支原体ELISA抗体检测试剂盒和PCR方法对采集的样品(血清和病料组织)进行支原体感染检测。参照牛支原体ELISA抗体检测试剂盒说明书检测血清中牛支原体抗体水平；参照文献[12-13]报道的牛支原体16S rRNA通用引物，5′-CCTTAGGCAGTTTCTTTATAA-3′，5′-CATGCATGTCGAGCGATGAT-3′，目的片段大小为253 bp，以提取病料组织DNA为模板，进行牛支原体的PCR检测，根据牛支原体血清抗体水平和PCR检测结果，统计牛支原体感染率。

1.2.2 分离与培养 对牛支原体血清抗体水平和PCR检测阳性的病料组织，进行研磨、离心取上清过滤处理后接种于加入有酚红的PPLO液体培养基中密封，37℃恒温、5% CO2培养箱中培养36 h～44 h，每日观察2次～3次，待颜色变黄后过滤，传代4次后，将其接种于改良Frey固体培养基上，肉眼观察直到出现中央凸起呈荷包蛋样的典型支原体菌落，姬姆萨染色观察其形态。

1.2.3 分离菌株的生化试验 参照细菌微量生化鉴定管说明书进行山梨醇发酵、葡萄糖发酵、色氨酸肉汤(蛋白胨水)、MR、VP、氧化酶试纸、西蒙氏柠檬酸盐、鸟氨酸、精氨酸、氨基酸脱羧酶、纤维二糖、棉子糖、尿素等生化鉴定。

1.2.4 分离菌株的PCR鉴定 取中央凸起呈荷包蛋样的典型支原体菌落的菌株进行扩大培养，按照DNA提取试剂盒说明提取菌株的基因组DNA，置-20℃保存。采用1.2.1牛支原体16S rRNA通用引物，用提取的菌株基因组DNA为模板进行PCR鉴定，挑去鉴定为阳性的菌株用胶回收试剂盒回收PCR产物，送华大基因进行侧序，并将测序结果与在NCBI网站下载的参考株基因序列用Blast软件进行同源性比对。

1.2.5 药敏试验 参照美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的标准进行结果判断，分析分离菌株的耐药性，将分离菌株接种于PPLO液体培养基中，均匀涂布在PPLO固体培养上，每个培养基贴6种药物，每种药物3个重复，取平均值进行药敏试验判定。

2 结果

2.1 牛支原体感染检测结果

采用ELISA和PCR对采集的样品进行牛支原感染检测。结果见表1，共检出阳性样品431份(ELISA和PCR均为阳性)，总阳性率为33.3%。其中2019年、2020年、2021年密云地区的牛养殖场牛支原体感染率分别为28.7%、32.8%和38.1%，呈现逐年上升趋势。

表1 牛支原体检测结果Table 1 Test results of Mycoplasma bovis

2.2 分离培养结果

从牛支原体血清抗体水平和PCR检测阳性的病料组织进行牛支原体分离鉴定，疑似牛支原体菌株在改良Frey固体培养基上厌氧条件下培养3 d时，长出透明、圆形、光滑似露珠状菌落，呈现典型的“煎蛋样”菌落(图1)，姬姆萨染色后显微镜观察可见卵圆形、弯曲的丝状、螺旋状等多种形态的菌体(图2)

图1 菌株的“煎蛋样”菌落Fig.1 "Fried egg like" colonies of the strain

图2 显微镜的菌株形态学 (1000×)Fig.2 Microscopic morphology of the strain (1000×)

2.3 分离菌株的生化试验

疑似支原体菌株均不能发酵葡萄糖、不分解甘露醇、不能水解精氨酸、不分解尿素，磷酸酶活性为阳性。与《伯杰细菌鉴定手册》中牛支原生化特性一致。经过统计，从431份阳性样品中分离得到103株菌株，初步鉴定为牛支原体。

2.4 分离菌株的PCR鉴定

对初步鉴定为支原体的分离菌株，用16S rRNA通用引物进行PCR鉴定。结果显示，以分离菌株基因组DNA为模板，均能扩增到约为253 bp的目的条带，与预期结果相符(图3)。扩增产物测序后与NCBI中报道的牛支原体16S rRNA序列同源性为98.0%以上，测序比对结果表明分离株均为牛支原体。

2.5 药敏试验检测结果

用K-B药敏纸片法对分离的103株牛支原体进行药敏试验，分析其耐药性。由表2所示结果可知，分离的103株牛支原体对土霉素、金霉素、多西环素、卡那霉素、泰乐菌素、替米考星、泰妙菌素、氟苯尼考等10种抗生素耐药率较高，耐药率为41.7%～100.0%，对林可霉素、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、沙拉拉星、阿奇霉素6种抗生素耐药相对较低，耐药率为15.5%～31.1%。

表2 103株牛支原体耐药性结果分析Table 2 Analysis of drug resistance test results of 103 strains of Mycoplasma bovis

由表3可知，分离的103株牛支原体呈现多重耐药性，耐14、6、5种药物的各有6株、耐13、7种药物的各8株、耐12、8种药物的各10株、耐4种药物的有5株、耐11、10、9种药物的分离菌株最多，分别占分离菌株的19.4%、22.3%和24.3%。

M.DL 2 000 标准；1.空白对照；2～16.分离菌株 M.DL 2 000 Marker;1.Blank control;2-6.Isolates图3 牛支原体PCR鉴定结果Fig.3 PCR results of Mycoplasma bovis

表3 多重耐药性检测结果Table 3 Detection results of multidrug resistance test

3 讨论

牛支原体入侵宿主的细胞后定植在健康牛的上呼吸道，可以利用自身的菌毛、表面可变脂蛋白、生物膜等多种方式侵入牛的免疫系统，引起免疫反应，并刺激感染体产生以 IgG1 为主的抗体类型，导致严重的肺部炎症，引起一系列的病变反应，病死率较高[14-16]。研究表明，牛支原体可在宿主牛体内长期存在，可造成慢性持续感染[17-18]。本研究表明，2019年-2021年密云地区的肉牛养殖场牛支原体感染的阳性率分别为28.7%、32.8%和38.1%，且呈现逐年上升趋势,与李书光等[17]、郭亚男等[19]报道牛支原体在肉牛、奶牛养殖场广泛流行一致。

临床预防支原体病的疫苗效果不是很理想，对该病的控制主要是抗体检测、净化、抗生素治疗等，由于不合理的使用，导致支原体耐药菌株出现[20]。临床上，支原体经常与呼吸道病毒或者巴氏杆菌混合感染，给该病的诊断与防治带了一定的困难。当发生支原体感染时应该进行药敏试验，选择敏感药物合理使用，提高治疗效果，同时配合消毒。本试验表明，103株牛支原体菌株对临床常用的14种药物均产生了很强的耐药性，且呈现多重耐药，应该引起重视。因此，在临床中应该推荐选用林可霉素类、喹诺酮类药物进行治疗。本研究对密云地区规模化牛场支原体病的治疗有一定指导意义，在临床治疗过程中应该合理的交替使用药物，并采取综合性防控措施如消毒、检测净化等。