鱼肉中喹诺酮类兽药残留检测测量不确定度评定

段洪峰

(淮南市农产品质量安全检测中心，安徽淮南 232000)

喹诺酮类药物(quinolones)，又称吡酮酸类或吡啶酮酸类，是人工合成的含4-喹诺酮基本结构的抗菌药，其发展迅速，目前已有四代产品。因其具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性、毒副作用小、组织穿透力强、结构简单、给药方便等特点，被广泛应用于水产养殖中，主要作用是促进畜禽和鱼类生长以及预防治疗疾病，在水产养殖业中用于疾病防治，由于缺乏相应的科学理论指导，长期不合理使用这类抗菌药，导致细菌产生耐药性，在动物体内积累产生一定的残留，对人体健康构成威胁，若长期食用被此类药物残留物染的食品，可能诱导人类病原微生物产生耐药性和抗药性，严重时，会对食用者产生直接毒性及潜在“三致”(致癌、致畸、致突变),从而影响该类药物的临床疗效，控制喹诺酮类药物在水产品中的残留至关重要。因此，检测水产品中喹诺酮类兽药残留并保证结果的可靠性十分重要，那么评定其不确定度就具有重要意义。目前常用的检测方法有高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法，采用液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星能更加准确的定量。

测量不确定度作为测量结果的一部分，合理表征了被测量值的分散性，对测量结果的可信性、可比性和可接受性都有重要影响，是评价测量活动质量的重要指标。该试验采用农业部1077号公告-1—2008方法对鱼肉样品中4种喹诺酮类兽药残留进行检测，待测草鱼样品来源于淮南市2021年风险监测抽样。

1 材料与方法

PL602E、XA205DU电子天平(梅特勒-托利多)；I-Class XEVOTQ-Micro超高效液相色谱质谱联用仪(美国Waters公司)；环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星液标混标，氘代环液沙星、氘代恩诺沙星内标混标(天津阿尔塔)。

标准溶液稀释。准确吸取环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星100 μg/mL的液标混标储备液1 mL，置于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度线配制成1 μg/mL的标准工作液A，再吸取A液1 mL置于10 mL容量瓶中配制成0.1 μg/mL的混合标准工作液B；用同样的方法将内标混标储备液稀释成1 μg/mL的混合内标标准工作液；吸取一定量的混合内标标准工作液分别加入空白样品中，经过前处理上机得到浓度为5、10、20、50、100、200 ng/mL的工作曲线。

样品前处理。称取(5.00±0.02)g鱼肉样品于50 mL离心管中，准确加入50 μL混合内标标准工作液，涡旋混合30 s，避光放置10 min,加入5 g无水硫酸镁，涡旋混匀，再加入20 mL酸化乙腈，涡旋混合1 min,超声提取10 min;7 000 r/min 离心5 min，取上清液于125 mL梨形瓶中。残渣再重复提取一次，合并2次提取液，于40 ℃旋蒸至干。加1.0 mL甲醇溶液溶解残留物并过0.2 μm滤膜，最后用液相色谱-串联质谱仪测定。

测定结果由仪器工作站按内标法自动计算，样品中喹诺酮类兽药残留量按公式(1)计算。所有的数据均按照《数值修约规则与极限数值的表示和判定》方法进行修约。

(1)

式中，为样品中待测组分的含量(μg/kg)；为测定液中待测组分的浓度(ng/mL)；为样品定容体积(mL)；为样品称样量(g)。

2 结果与分析

依据JJF 1059.1—2012，评估不确定度时，应该是集中精力分析贡献最大的不确定度分量，然后合成标准不确定度，给出扩展不确定度，最后准确表述检测结果。对检测和校准结果测量不确定度来源的识别应从分析测量过程入手，即对测量方法、测量系统和测量程序进行详细研究。该试验不确定度来源主要有样品称量、标准溶液、方法回收率、样品定容、结果重复性以及最小二乘法拟合曲线引入的不确定度，将所有不确定度来源进行整理，然后再逐个进行分析。鱼肉中喹诺酮类兽药残留检测的不确定度来源如图1所示。

图1 不确定度来源Fig.1 Sources of uncertainty

标准溶液不确定度来源主要有标准溶液浓度、标准溶液稀释和标准溶液添加。

标准溶液稀释引入的不确定度。标准溶液进行两级稀释，用到100、10 mL容量瓶以及1 000 μL移液枪，不确定度来源主要有容量瓶和移液枪的校准、温度、重复性，不确定度分量如下。

100 mL容量瓶引入的不确定度。

(2)温度变化引入的不确定度。容量瓶检定温度为22 ℃，实验室温度变化为±4 ℃，甲醇的膨胀系数为0.001 24，甲醇的体积变化△=±0.496 mL，按矩形分布，则温度变化引入的标准不确定度为(V)=0.290 mL。

(3)重复性引入的不确定度。10次重复称量得到标准偏差为0.023 mL，则重复性引入的标准不确定度为(V)=0.023 mL。

100 mL容量瓶引入的标准不确定度为(V)=0.290 mL，相对标准不确定度为(V)=0.002 9。

10 mL容量瓶引入的不确定度。计算过程同“...”，容量允差为±0.020 mL，校准引入的标准不确定度为(V)=0.008 mL，温度变化引入的标准不确定度为(V)=0.029 mL，10次重复称量得到标准偏差0.003 mL，重复性引入的标准不确定度为(V)=0.003 mL，则10 mL容量瓶引入的标准不确定度为(V)=0.030 mL，相对标准不确定度为(V)=0.003 0。

标准曲线添加引入的不确定度。用50、200 μL移液枪添加6个浓度点绘制标准曲线，不确定度来源主要有校准、重复性、温度;按矩形分布，计算过程同“..”，标准曲线添加引入的相对标准不确定度(add)=0.046 0。

样品定溶液为3%甲醇水溶液，用1 000 μL移液枪移取，计算过程同“..”；校准引入的标准不确定度为(V)=5.8 μL，温度变化引入的标准不确定度为(V)=4.7 μL，重复性引入的标准不确定度为(V)=1.4 μL，则样品定容引入的标准不确定度为(V)=7.6 μL，相对标准不确定度为(V)=0.007 6。

在重复性条件下对样品进行9次独立测试，采用贝塞尔公式法计算标准不确定度，测试结果及不确定度如表2～3所示。

表1 各组分的标准不确定度

表2 重复测量结果

表3 各组分的不确定度

采用6个浓度点各测定一次，用最小二乘法拟合成直线得到不同浓度的响应值()的线性标准曲线=+C，由于内标峰面积参与响应值计算，故不考虑内标的不确定度，具体数据如表4所示。计算公式如下：

表4 最小二乘法拟合曲线的不确定度

接下表

计算合成各分量的相对标准不确定度公式如下：

利用合成相对标准不确定度和结果的平均值计算合成标准不确定度()，扩展不确定度=()×，采用置信概率为95%，包含因子=2，结果表述如表5。

表5 样品的合成标准不确定度

3 结论与讨论

在日常检测活动中评定不确定度是必不可少的，目的是为了评价测量结果的可靠性，能更加直观地发现整个试验过程中影响测量结果的各类因素，通过分析各类因素的测量不确定度对试验的各个部分进行补充、优化，从而降低各不确定度分量给结果带来的影响，让测量结果更加准确。鱼肉中喹诺酮类兽药残留检测试验采用的是空白基质添加曲线，然后再用与样品相同的前处理方法进行处理，用这种方式绘制标准曲线可以尽可能减小样品前处理、基质等带来的误差影响，使测量结果更加准确；与大多数用溶剂配制标准曲线试验的不确定度评定有所不同，鱼肉中喹诺酮类兽药残留检测测量不确定度评定增加了标准曲线添加所引入的不确定度，最后通过观察所有的不确定度分量的结果，发现标准曲线添加引入的不确定度带来的影响不容忽视，说明评定标准曲线添加引入的不确定度是有必要的。影响测量结果的不确定度分量不仅只有鱼肉中喹诺酮类兽药残留检测测量不确定度评定中计算的最小二乘法拟合标准曲线、回收率以及标准溶液等，还有很多其他因素对测量结果能产生影响，如抽样、样品制备、净化时间、仪器设备等，将来都应该要纳入不确定度的评定中。