冻干狂犬病疫苗热原检测在HL-60单核细胞激活实验中的方法转移和验证研究

杨泽岸，陈 晨，张 媛，王 灿，高 华，吴彦霖

(1.中国食品药品检定研究院 北京 102629 2.上海食品药品检验所,上海 201203)

疫苗质量安全问题也日益受到公众关注，其中热原反应(pyrogen reaction)是临床常见的不良反应之一。热原反应系经非肠道给药0.5～1 h内出现的冷颤、高热、出汗、昏晕、呕吐，甚至休克等现象，能引起恒温动物体温异常升高的致热物质称为热原[1]。热原包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。药物中的热原物质主要指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌外壁及内毒素(endotoxin)。细菌内毒素，又称脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)，是革兰阴性菌的产物，其致热能力最强[2]。热原检查方法包括家兔热原检查法(rabbit pyrogen test，RPT)、细菌内毒素检查法(bacterial endotoxin test，BET)和单核细胞激活实验(monocyte activation assay，MAT)[3-9]。

基于ISO 17025 的规范性文件中关于方法学验证的内容，各国药品监管机构发布的指导原则提出了方法验证(method validation)、方法转移(method transfer)和方法确认(method verification)的概念，用于保证检验方法适合于检验、被检样品的质量可控，并确保检验人员有能力去操作方法，根据目的、检验人员、检验环境等因素的不同，以上3个概念的内涵和侧重点又有所不同。method validation的核心是实验室通过试验设计和测试，证明被验证的方法适用于该方法拟定的检测用途。method validation主要由方法建立者进行，方法建立者必须要证明所建立的方法能够满足期望的检测用途。method transfer是一个实验室建立了经过验证的分析方法，当其他实验室(方法接收实验室)在使用这个方法进行检验检测时，就牵涉到方法在2个及以上不同实验室之间的转移问题，接收方法的实验室需要证明其能够成功地在本实验室中运行该方法。常见的method transfer有：分析方法由公司的研发实验室转移到质控实验室[10-12]。在方法的协作标定过程中，协作单位接收组织者提供的HL-60-IL-6单核细胞激活实验方法[13-14]，并基于组织者的要求进行方法关键指标的测试和研究，协助完成方法的建立和验证，上述环节涉及method transfer和method validation两个环节。因此，我们首先按照组织者要求对LPS刺激HL-60分泌IL-6法进行了方法的transfer和validation，并使用经过validation的方法进行了人狂犬疫苗的品种适用性研究。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂细胞：人早幼粒白血病细胞HL-60，中国科学院细胞库，细胞及鉴定结果由上海药检所提供[16]。

试剂：胎牛血清、IMDM、胰酶(Gibco公司，批号1347556、1897074、1095511)；人白介素-6(IL-6)酶联免疫(ELISA)试剂盒(BD OptEIATM公司，批号7118747EU；R&D公司，批号P134546；欣博盛生物科技有限公司，批号H170523-003a和H190716-007a)；LPS国家标准品(中国食品药品检定研究院，批号150800-201601)；冻干人用狂犬病疫苗：10个厂家13批及热原不合格样品对应的3批疫苗附的注射用水(16批样品)。

1.2 主要仪器CKX 41倒置显微镜(Olympus公司)；1389 A2生物安全柜(Thermo Fisher公司)；3141 CO2培养箱(Thermo Fisher公司)；6R离心机(Beckman Coulter公司)：Z2细胞计数仪(Beckman Coulter公司)；SYNERGY MX和SYNERGY HT酶标仪(Biotek公司)。

1.3 方法

1.3.1方法转移 1)LPS 标准品溶液的配制 在无菌条件下，将LPS国家标准品用细菌内毒素检查用水复溶至10 000 EU·mL-1，在涡旋混合器上混匀15 min，用维持培养液稀释成0，0.015 6，0.031 2，0.062 5，0.125，0.25，0.5，1.0，10，100 EU·mL-1一系列浓度，每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30 s。2)细胞检测体系的建立 取对数生长期细胞，稳定传代2～3次，调整HL-60细胞密度至每1 mL约含1.0×105～1.0×106个细胞，于20%胎牛血清的IMDM细胞培养液，37 ℃，5% CO2条件下培养。选择8～20代次的细胞用于实验。取细胞悬液适量，1 000 r·min-1离心20 min，弃去上清液，用维持培养液(含2%FBS的IMDM培养基)调整细胞密度为每1 mL约含1.0×106个细胞，100 μL每孔接种于96孔U型板，加入100 μL 3.1或供试品溶液，平行3孔，于37 ℃，5% CO2条件下培养48 h，取细胞上清，使用ELISA试剂盒检测IL-6含量，计算450 nm处的吸光度A值与LPS浓度的关系，即为HL-60 MAT实验检测体系。

1.3.2方法验证 参考2015年版《中国药典》四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则，对方法的线性及范围、准确度、精密度、重复性、耐用性进行验证[17]。

1)线性 以LPS浓度为横坐标，吸光度A值为纵坐标进行四参数拟合。R2不得低于0.95，计算该体系对应的最低检测限。最低检测限=空白孔实测平均A值+3倍标准偏差(+3 s)。

2)重复性 取1名人员3次独立实验结果，3次最低检测限结果应不超过50%～200%。

3)准确度 在维持培养基中加入接近反应曲线 EC50的LPS浓度溶液作为添加已知的标准品溶液浓度，配制方法同3.2，计算回收率%。

回收率%=(实测值-溶液中所含被测成分值)/加入标准品量×100%

4)耐用性 细胞自购买起为1代，建库留种，取8、16、21和24代细胞进行灵敏度检测，考察指标为最低检测限；考察2家公司的IL-6 ELISA检测试剂盒对检测结果的影响。

1.3.3冻干人用狂犬病疫苗样品的HL-60单核细胞激活实验检测 选用10个厂家共计13批次样品，对其中RPT和BET检测不合格的样品附带的注射用水3批进行检查，按照《中国药典》品种项下进行最大稀释倍数MVD的计算，按照公式L=K·M-1，确定供试品的热原物质限值(L)。其中，K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU·(kg·h)-1表示，注射剂K=5 EU·(kg·h)-1，M为人用每千克体重的最大供试品剂量，以mL·(kg·h)-1、mg·(kg·h)-1或U·(kg·h)-1表示，中国人均体重按60 kg计算，人体表面积按1.62 m2计算。注射时间若不足1 h，按1 h计算。按照L按照标准每剂不得大于25EU，规格为0.5 mL和1.0 mL。按照公式MVD=C·L/·λ-1，λ为检测体系的最低检测限，每一步稀释比不得大于1 ∶10，每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30秒[18]。

1.3.4细菌内毒素动态显色测定法 按《中国药典》四部(2015 版)[18]通则1143细菌内毒素检查法项中光度测定法进行冻干人用狂犬病疫苗的细菌内毒素含量检测。

1.3.5热原检查法按《中国药典》四部(2015 版)[19]通则1142热原检查法项进行冻干人用狂犬病疫苗的热原检测。

2 结果

2.1 方法验证

2.1.1线性 当LPS浓度为0、0.0156、0.0312、0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、10、100 EU·mL-1时，致HL-60细胞分泌的细胞因子IL-6含量的吸光度A值通过logistic四参数回归，呈现很好的量效关系(Fig 1)，R2值均>0.95。

Fig 1 Dose-response relationship of IL-6 secretion byHL-60 induced by different concentrations of LPS standard

2.1.2重复性 使用BD OptEIATM公司和R&D公司生产的人IL-6 ELISA试剂盒分别进行3次试验，计算R2值和最低检测限。2个厂家吸光度A值差异比较大，但通过试剂盒自带标曲计算IL-6含量，2个厂家对IL-6含量的检测一致。表明HL-60-IL-6检测体系重复性符合1.3.2要求，最低检测限的波动范围在50%～200%之间(Tab 1)。

Tab 1 Linearity and repeatability(n=3，3 independent experiments for 2 manufacturers)

2.1.3准确度 将LPS浓度0.5和1.0 EU·mL-1作为已知浓度标准品溶液加入检测体系，平行6孔，独立进行5次实验，检测体系的LPS含量为0 EU·mL-1，实测值为0.01 EU·mL-1(Tab 2)，LPS浓度0.5和1.0 EU·mL-1的回收率在91%～110%。

2.1.4耐用性 参考重复性实验结果，在比对了BD OptEIATM公司和R&D公司生产的人IL-6 ELISA试剂盒检测的基础上，进行欣博盛生物科技有限公司2个批号的人IL-6 ELISA试剂盒检测，通过logistic四参数回归，LPS浓度与HL-60分泌IL-6含量呈现很好的量效关系，R2值均>0.95，最低检测限为0.5和1.0 EU·mL-1，灵敏度与细菌内毒素检查法相比无明显优势。

Tab 2 Accuracy test results n=6，5 independent experiments for 2 concentrations)

使用R&D公司比较了8、16、20和24代的细胞的灵敏度，24代细胞与8代细胞的吸光度A值相比降低超过80%，最低检测限分别为0.0625、0.0625、0.5和10 EU·mL-1，且24代细胞0.5、1.0和10 EU·mL-1剂量组间差异无显著性，基于此，检测体系建议使用20代次以内的HL-60细胞用于单核细胞激活实验的检测。

2.2 冻干人用狂犬病疫苗样品的HL-60单核细胞激活实验《中国药典》2015年版二部冻干人用狂犬病疫苗品种项下规定的细菌内毒素含量不得超过25 EU·剂-1，检测体系最低检测限为0.125 EU·mL-1，参照细菌内毒素检查法中光度测定法中的干扰试验，以1.0 EU·mL-1作为干扰浓度，计算检测样品中的LPS含量(Tab 2)。编号14-16为BET检验不合格样品附带安瓿装水，表明HL-60-IL-6法、BET法和RPT法检测结论一致。

3 讨论

3.1 热原补充方法的研究为了确保非肠道用药的质量和安全，尤其是静脉注射用药，热原检测技术日益至关重要，各国药典也相继收载多种热原检测方法，包括家兔热原检查法、细菌内毒素检查法和单核细胞激活实验。RPT被认为是检测热原的“金标准”，可全面、直观反应药物的临床风险，其缺点是不能定量、灵敏度低、结果重复性差、费用较高、使用活体动物等，且RPT不适用于放射性药物、化疗药物、免疫抑制剂等影响家兔发热药物的热原检测。BET可半定量或定量检测药物中细菌内毒素(含量，灵敏度较高，重复性好，其缺点是只能检测革兰阴性菌来源的LPS，不能检测其他来源的热原[15]。目前，《英国药典》、《欧洲药典》均已收录了MAT，用于热原检测，于2005、2006年已有7种方法分别得到欧洲权威机构的验证：7种推荐的方法有人全血法(新鲜人全血-IL-1β、新鲜人全血-IL-6和冻存人全血-IL-1β)，人外周血法(PBMC-IL-6)和细胞系法(MM6-IL-6、THP1-新喋呤(Neo)、THP1-TNFα)[17]。其中，人全血和人外周血对人血的要求较高，而且来源困难。而细胞系法中推荐的两株细胞MM6和THP-1-新喋呤(Neo)细胞无法获得，限制了该方法的推广应用。

Tab 3 Results of freeze-dried human rabies vaccine HL-60-IL-6 method，BET method and RPT method

此外，细菌内毒素检查法须使用专用试剂—鲎试剂系从国家二级保护动物鲎体内血液提取，由于环境恶化、过度捕捞(提取鲎试剂是捕捞鲎的主要目的之一)等原因，使我国鲎资源锐减，因而对鲎资源的保护迫在眉睫[16]。本实验所采用的HL-60细胞系人源细胞，不再使用鲎、家兔等动物，消除了种属差异，可作为热原物质检查方法的有力补充。HL-60-IL-6单核细胞激活实验对冻干人用狂犬病疫苗样品的检测结果表明，该方法灵敏度高，重现性好，可以对热原进行定量检测。且根据文献报道，该法不仅用于LPS检测，还可用于革兰氏阳性菌脂磷壁酸，真菌酵母多糖类热原物质的检测，具有广谱检测多种热原的能力，亦可避免使用人血或单核细胞所产生的伦理问题，从而更好地保障冻干人用狂犬病疫苗的临床用药安全，尽可能减少因热原污染导致的不良反应。

3.2 方法协作标定的研究一个方法的研究从实验室内建立、实验室内验证开始，到实验室间转移和再验证完成，经由多个实验室不同人员对方法进行研究。对于方法协作标定实验室在接收到方法时，涉及的再验证项目、实验过程中考核指标的实验次数、符合要求评判标准等具体问题，我国尚无明确规定。大多数方法协作标定的实验室均基于2015年版《中国药典》四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则进行了方法的再次验证或部分验证[17]。国家药典委员会进行了关于《中国药典》2020年版四部通则增修订内容(第十九批)的公示，在《分析方法转移指导原则》公示稿中规定：“对分析方法转移的可接受方法还包括再验证或部分验证。再验证时，应对通则9101《分析方法验证指导原则》中收载的可能在转移中受到影响的验证指标进行说明”。有望在《中国药典》2020年版四部通则中增加《分析方法转移指导原则》，为相关的方法协作标定研究提供了理论指导和支持。