PINK1介导的线粒体自噬对大鼠骨髓内皮祖细胞衰老及其功能的影响

唐 蜜,石永芳，肖 珍，梁 梅，秦 臻

(贵州医科大学基础医学院,贵州 贵阳 550025)

随着人口老龄化速度加剧，冠心病、心梗等缺血性心血管疾病的发病率与死亡率逐年攀升，如何有效防治其发生发展具有重要的意义。近年来利用内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)介导的心血管治疗已成为再生医学研究的热点[1-2]。EPCs作为主要定居于骨髓，具有游走特性并能自我更新，增殖分化为血管内皮的前体细胞，在缺血缺氧等病理生理的作用下，可随着血液循环募集至缺血组织，修复损伤血管[3]。随着研究的不断深入，通过体外培养自体EPCs移植修复损伤内皮对缺血性心血管疾病的治疗具有很好的应用前景[4]。但衰老机体的EPCs在体外培养时由于老化过快，难以维持增殖活性而无法发挥修复作用[5]。活性氧(reactive oxygen species,ROS)与细胞衰老密切相关，我们前期研究也发现，EPCs在体外培养时其衰老程度逐渐加重并伴有ROS水平的急剧上升[6]。线粒体作为产生ROS的主要场所，其功能失常被证实与衰老进展有关，而线粒体自噬可通过选择性的清除衰老或受损的线粒体，调节线粒体质量，维持细胞稳态[7-8]。因此我们推测线粒体自噬与EPCs衰老之间可能存在某种联系，本文从较为经典的PINK1介导的线粒体自噬通路入手，通过小干扰RNA技术敲减PINK1基因，以确定最佳敲减时间，并以此为据点选取不同时间点模拟衰老进程来观察EPCs衰老与PINK1介导的线粒体自噬之间的关系，以期为EPCs衰老机制的研究提供一些思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 健康SPF级SD大鼠20只，20月龄，雌雄各半，体质量(560～600)g；贵州医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(黔)2018-0001；光照12 h，环境：湿度50%～70%，温度20 ℃～26 ℃，采用灭菌饮用水和标准鼠饲料喂养。

1.1.2主要试剂 M199培养液(2187131)、胎牛血清(2254375CP)、OPTI-MEM培养液(2177581)均购自Gibco公司；碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，1210432-1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF，1107436)均购自PeproTech公司；大鼠骨髓淋巴细胞分离液(TBD2013LR)购自天津灏洋生物科技有限公司；PINK1、p16抗体(ab23707，ab51243)均购自英国Abcam公司；Parkin、p62、LC3抗体(2132S，39749S，4108S)均购自美国CST公司；磷酸盐缓冲液购自Gibco公司；FITC 标记的荆豆凝集素1(FITC-UEA-1)购自美国Sigma 公司；Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)购自广州奕源生物科技有限公司；siRNA干扰序列及GP-transfect-Mate转染试剂购自吉玛基因公司；荧光定量PCR试剂盒购自Servicebio公司；活性氧检测试剂盒与SA-β-半糖苷酶染色试剂盒均购自碧云天公司；CCK-8试剂盒购自absin公司；体外血管生成试剂盒购自Millipore公司；Transwell小室购自Corning公司。

1.1.3主要仪器 IX71荧光显微镜(日本Olympus公司)；TS100倒置显微镜(日本Nikon公司)；多功能酶标仪(美国Thermo Fisher公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；实时荧光定量PCR仪(德国Eppendorf公司)；冷冻离心机(美国Thermo Fisher公司)；CO2培养箱(美国Thermo Fisher公司)；透射电镜(日本Hitachi公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠骨髓源EPCs的培养及鉴定 采用脱颈法将大鼠处死，剪下两侧大腿，浸入75%的酒精中消毒，无菌环境中分离双侧股骨与胫骨，无菌注射器抽取PBS冲洗髓腔，收集细胞悬液，并通过200目细胞筛进行过滤，按2 ∶1的体积比将重悬液缓慢加入骨髓淋巴细胞分离液中，两者之间形成清晰界面。1 500 r·min-1离心20 min，收集白色絮状物层，加入PBS吹打混匀，密度梯度离心法分离得到的骨髓单个核细胞，用PBS洗涤2次，每次10 min。获得的细胞团块用含10 μg·L-1的VEGF和bFGF、20%胎牛血清的M199全培养液进行重悬，接种于T25细胞培养瓶中，4 d后进行第一次换液，此后每3 d换液1次，记录细胞生长特性；并继续培养收集约10 d的细胞，采用双染色法进行鉴定，PBS洗2次后，将细胞与Dil-ac-LDL于37 ℃孵育4 h，多聚甲醛固定20 min后，PBS洗3次，加入10 mg·L-1的 FITC-UEA-1于37 ℃孵育1 h，弃去后PBS洗3次，荧光显微镜下观察。

1.2.2细胞分组及转染 将EPCs计数后在6孔板中进行培养，同步化24 h后，将其随机分为3组：空白组、NC siRNA组、PINK1 siRNA组，空白组正常培养，另外两组分别予以NC siRNA及PINK1 siRNA进行转染。当细胞密度达到60%～80%时，按照转染试剂说明书进行操作，将含转染试剂的培养基混合物滴加至RNA oligo培养基混合物中，轻轻混匀，室温静置20 min后，立即转染。弃去原有培养基，PBS洗2次后每孔加入1.5 mL预热的新鲜培养基，再将配好的转染混合液加入其中，轻轻混匀，培养箱中孵育6 h后，换为全培养基，继续培养至不同时间。

1.2.3qRT-PCR法检测各组细胞中PINK1 mRNA的表达 将转染24 h与48 h后的各组EPCs，分别进行收集，运用TRIzol法将各组细胞的总RNA提取后，依据逆转录说明书合成单链cDNA，并以cDNA为模版，参照PCR试剂盒说明书进行扩增，以GAPDH(138 bp)为内参上游引物序列为：5′-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3′，下游引物序列：5′-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3′，PINK1(113 bp)的上游引物序列为：5′-TGCAATGCCGCTGTGTATGA-3′，下游引物序列：5′-TCTGCTCCCTTTGAGAC-GAC-3′，反应条件：95 ℃预变性10 min后，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，扩增40个循环，采用 2- ΔΔCt法计算各组细胞中PINK1 mRNA表达水平。

1.2.4Western blot法检测各组EPCs中PINK1蛋白表达水平 将转染24 h、48 h后的各组细胞，弃去原培养液，预冷的PBS清洗2次，加入适量含PMSF的RIPA裂解液，使用细胞刮将细胞刮取后收集，12 000 r·min-1，4 ℃离心10 min，提取细胞总蛋白。根据BCA蛋白定量试剂盒的说明检测总蛋白浓度，按比例将蛋白样品与上样缓冲液混匀。将蛋白样品热变性后加入制好的SDS-PAGE凝胶中进行电泳，转膜。使用Quick Western封闭液将膜封闭15 min，用TBST液清洗PVDF膜每次10 min，共3次，再加入特异性的一抗(PINK1抗体、GAPDH抗体)，4 ℃环境慢摇过夜。次日，用TBST液洗3次，每次10 min，再加入二抗，室温下孵育2 h，TBST液洗3次，每次10 min。化学显影液进行曝光，得到目的条带显影。再通过ImageJ软件对各个条带的灰度值进行比对分析。

1.2.5细胞衰老程度检测 将转染48、96 h的各组EPCs，依据SA-β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书操作。将原有细胞培养液弃去，PBS缓冲液洗3次，加入1 mL半乳糖苷酶染色固定液，室温下静置15 min，弃去固定液，用PBS缓冲液洗3次，每次3 min，加入1 mL染色工作液，置于37 ℃、无CO2培养箱孵育过夜。封口膜封住孔板防止液体蒸发，次日将染色工作液弃去，PBS洗涤后，于倒置显微镜下观察，衰老细胞的胞质呈蓝染，随机选取5个视野进行拍照，最后根据细胞蓝染数量计算出衰老细胞所占的百分比。

1.2.6细胞增殖能力检测 将转染48 h与96 h的各组EPCs计数后接种于96孔板中，每孔100 μL(5×103个)，于培养箱中培养24 h后，每孔加10 μL的CCK-8溶液，培养箱中继续孵育1～4 h，酶标检测仪于波长450 nm处进行吸光值检测。

1.2.7细胞迁移能力检测 分别将转染48 h与96 h的各组EPCs，用无血清培养基重悬，计数每孔300 μL细胞悬液(1×105个)加入Transwell小室的上室，下室加入M199全培养基700 μL。于37 ℃，CO2培养箱中培养24 h，将小室中的培养基弃去，PBS洗2次，再经多聚甲醛固定，结晶紫染色，拭去内室细胞，于显微镜下随机选取5个视野进行观察，计数迁移至下层的细胞，算出平均值。

1.2.8细胞成血管功能检测 按照体外血管生成试剂盒操作说明，将10×稀释液与ECMatfixTM胶液于4 ℃冰箱冻融，将900 μL ECM-atfixTM胶液与100 μL ECM 10×稀释液置于冰上混匀，加入96孔板中，每孔50 μL，勿产生气泡，培养箱中基质胶凝固1 h。将转染48、96 h的各组细胞计数后以150 μL(1×104个)接种于胶上，于37 ℃培养箱孵育2～4 h后，镜下随机5个视野，观察长度为宽度的4倍及以上的细胞，计数取其平均值。

1.2.9流式细胞仪检测ROS水平 按1 ∶1 000用无血清培养基稀释DCFH-DA，将转染48 h与96 h的各组细胞，胰酶消化后收集细胞，弃去上清，每管中加入适量DCFH-DA稀释液混匀，于培养箱中孵育20 min，每隔5 min颠倒混匀1次，使探针和细胞充分接触。用无血清培养基洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，最后用PBS重悬细胞，于流式细胞仪进行检测。

1.2.10Western blot法检测线粒体自噬及衰老相关蛋白表达水平 将转染48 h与96 h后的各组EPCs弃去原培养液，操作方法同1.2.4，电泳、转膜、封闭。TBST液清洗PVDF膜每次10 min，共3次，再加入一抗(PINK1、Parkin、LC3、p62、p16抗体、GAPDH抗体)，4 ℃环境慢摇过夜。次日用TBST液洗3次，每次10 min，再加入二抗，室温下孵育2 h。TBST液洗3次，每次10 min，化学显影液曝光，通过ImageJ软件对各个条带的灰度值进行比对分析。

1.2.11透射电镜观察线粒体自噬 将转染48 h与96 h的各组细胞，胰酶消化后离心收集细胞，弃去上清，沿离心管壁加入预冷的2.5%戊二醛溶液，4 ℃固定12 h，PBS缓冲液洗3次，每次10 min，1%锇酸4 ℃固定1 h后，PBS缓冲液洗3次，经乙醇及丙酮梯度脱水处理，再经过环氧树脂浸透、包埋、聚合后，超薄切片机切片；采用醋酸铀-柠檬酸铅进行双重染色，透射电镜下进行观察拍照。

2 结果

2.1 大鼠骨髓EPCs的分离培养及鉴定大鼠骨髓源单个核细胞在分离之初呈小圆形，在培养液中呈悬浮状态，培养5 d后贴壁细胞逐渐开始出现伪足样突起，首尾相连呈条索样分布；7 d后细胞出现集落生长并逐渐变为铺路石样(Fig 1A)。培养10 d左右，贴壁细胞经FITC-UEA-1和Dil-ac-LDL处理后，荧光显微镜下观察，EPCs摄取Dil-ac-LDL呈红色，结合FITC-UEA-1呈绿色，同时结合FITC-UEA-1与Dil-ac-LDL的细胞为正在分化的EPCs(Fig 1B)。

Fig 1 Cultivation and identification of EPCsA:a:At the beginning of separation of EPCs;b,c:The growth characteristics of day 5 and day 7 (100×);B:d:Adherent cells with Dil-ac-LDL were red;e:Cells binding FITC-UEA-1 were green;f:Double positive cells were differentiating EPCs (200×).

2.2 siRNA转染细胞后PINK1 mRNA和蛋白的表达水平qRT-PCR和Western blot结果(Fig 2)显示，在siRNA转染24 h后，与空白组相比，PINK1 siRNA组细胞PINK1 mRNA表达水平明显降低(P<0.01)，PINK1蛋白表明无明显变化；在转染48 h后，与空白组相比，PINK1 siRNA组细胞PINK1 mRNA及蛋白表达水平均明显降低(P<0.01)，NC siRNA组则无明显差异。

2.3 EPCs衰老程度的变化如Fig 3所示，在转染48 h、96 h后，与空白组相比，PINK1 siRNA组蓝染细胞数量增加，衰老阳性率明显升高(P<0.01)，p16蛋白表达水平也明显上调(P<0.05)，NC siRNA组无明显变化；组内比较，与转染48 h相比，转染96 h后各组中的蓝染细胞数量增加，衰老阳性率明显升高(P<0.05)，空白组与PINK1 siRNA组的p16蛋白表达水平也明显上调(P<0.05)。

2.4 EPCs增殖能力的变化如Fig 4所示，在转染48 h、96 h后，与空白组相比，PINK1 siRNA组的细胞增殖能力均明显下降(P<0.01)，NC siRNA组无明显变化。组内比较，与转染48 h相比，转染96 h后各组细胞的增殖能力均明显降低(P<0.05)。

2.5 EPCs迁移功能的变化如Fig 5所示，在转染48 h、96 h后，与空白组相比，PINK1 siRNA组的细胞迁移能力均明显下降(P<0.01)，NC siRNA组无明显变化。组内比较，与转染48 h相比，转染96 h后各组细胞的迁移能力均有所降低(P<0.05)。

2.6 EPCs成血管功能的变化如Fig 6所示，在转染48 h、96 h后，与空白组相比，PINK1 siRNA组成血管功能均明显下降(P<0.01)，NC siRNA组无明显变化。组内比较，与转染48 h相比，转染96 h后各组细胞的成血管功能均有所降低(P<0.05)。

2.7 各组细胞ROS水平的变化通过检测DCFH-DA平均荧光强度来反映胞内ROS的水平。如Fig 7所示，在转染48 h、96 h后，与空白组相比，PINK1 siRNA组细胞ROS水平均有所升高(P<0.01)，NC siRNA组则无明显变化。

Fig 2 The expression levels of PINK1 mRNA and protein in EPCs in various groups detected by qRT-PCR and Western blot n=3)A:PINK1 mRNA expression;B,C:PINK1 protein expression;a:control;b:NC siRNA;c:PINK1 siRNA.**P<0.01 vs control.

Fig 3 Cell senescence degree of EPCs obtained from various groups tested by SA-β-gal staining and Western blot n=3)A,B:At 48 h and 96 h after transfection,the blue-stained cells were senescent cells (×100) ;C,D:p16 protein expression;a:Control;b:NC siRNA;c:PINK1 siRNA.*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05 ,##P<0.01 vs 48 h.

Fig 4 Proliferation of EPCs in various groups n=3)**P<0.01 vs control;#P<0.05 vs 48 h.

Fig 5 Migration of EPCs in various groups n=3)A,B:The number of cells stained with crystal violet represented the migration ability of cells (100×).**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs 48 h.

Fig 6 Tubule formation of EPCs in various groups n=3)A,B:The number of tubule formation of EPCs indicated its tubule function (100×) ;**P<0.01 vs control;#P<0.05 vs 48 h.

2.8 Western blot检测线粒体自噬相关蛋白的表达在转染48 h、96 h后，与空白组相比，PINK1 siRNA组细胞的PINK1、Parkin、LC3蛋白表达均明显下调，而p62蛋白表达明显上调(P<0.05)，NC siRNA组无明显差异(Fig 8)。

2.9 透射电镜观察细胞线粒体自噬情况转染48 h后，各组肿胀变形的线粒体数量较少，转染96 h后，各组线粒体明显肿胀变形；各组均可观察到典型的呈双层膜结构的线粒体自噬体和被自噬小体包裹的受损线粒体，还出现了线粒体自噬体与溶酶体融合的现象，而PINK1 siRNA组的自噬体数量较空白组明显减少(Fig 9)。

3 讨论

大量研究表明，诸多危险因子造成的动脉内皮细胞功能失调和损伤是缺血性心血管疾病发生的始动环节[9]。动脉内皮细胞损伤可由周围的内皮细胞增殖修复，但当其衰老时此种修复功能明显减弱，成熟的内皮细胞属于终末分化细胞，替代能力有限，而EPCs作为具有强大增殖能力的干细胞，可迁移至受损血管，修复损伤内皮和构建血管网络，同时通过分泌细胞因子，重建血管[10]。因此，近年来利用体外培养的自体EPCs移植治疗缺血性心血管疾病的细胞干预法已成为再生医学的新策略之一。然而，缺血性心血管疾病多发生于老年患者，老年机体的EPCs在体外培养过程中会较快出现细胞增殖活力下降，分化停滞等衰老表现，这使其临床应用受到极大限制[11-12]。

Fig 7 ROS levels of EPCs in various groups by flow cytometry n=3)A,B:Overlay map of fluorescence histogram and histogram of mean fluorescence intensity of various groups.**P<0.01 vs control.

Fig 8 Mitophagic protein expression levels detected by Western blot n=3)A,B:The mitophagic protein levels in EPCs were detected by Western blot 48 h after transfection;C,D:The mitophagic protein levels in EPCs were detected by Western blot 96 h after transfection;a:control;b:NC siRNA;c:PINK1 siRNA.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

Fig 9 Autophagosomes and mitochondria in EPCs detected by TEMBlack arrows represented the characteristic double-membrane ultrastructural morphology of autophagic vacuoles (4 000×).

细胞衰老是指细胞的增殖活性转变为不可逆的停滞状态，无法发挥正常的细胞功能。自由基假说作为经典衰老假说之一，该假说认为细胞中自由基不断产生诱发分子损伤积累是细胞衰老的主要潜在原因[13]。在我们前期研究中也发现，ROS水平在EPCs衰老进程中逐渐升高。而线粒体作为ROS产生的主要来源，其功能失常常被认为与衰老进程密切相关，这主要通过线粒体损伤→ROS更多的释放→线粒体进一步损伤→细胞衰老这一恶性循环表现出来[14]。而线粒体自噬在维持线粒体功能稳态方面至关重要，线粒体自噬可选择性的对受损及衰老的线粒体进行清除，减少ROS的过度积累，进而中断恶性循环，来对抗细胞衰老[15]。目前存在多条信号分子通路来调节线粒体自噬，而PINK1介导的线粒体自噬是作为年龄相关疾病研究最为广泛的经典线粒体自噬通路，PINK1是一种线粒体靶向的丝氨酸/苏氨酸激酶，也是线粒体外膜蛋白，Parkin是胞质中的一种E3泛素-蛋白连接酶[16]。PINK1作为Parkin的上游，直接或间接通过磷酸化作用激活Parkin来启动线粒体自噬，之后p62与受到Parkin泛素化的蛋白底物作用并结合至LC3上，受损线粒体与溶酶体融合为线粒体自噬溶酶体，从而清除受损线粒体，终止ROS的过度积累[17-18]。然而，线粒体自噬在EPCs衰老进程中的作用尚不清楚。

据此，我们首先采用小干扰RNA转染细胞，多时间点观察PINK1的敲减效率，检测到PINK1 siRNA组在转染后48 h时，其PINK1 mRNA和蛋白表达均出现明显下调，这表明48 h时PINK1已被有效敲减。为通过时间差异模拟衰老进程，因此后续选择两个时间点(48 h和96 h)动态观察了细胞衰老和功能的变化。半乳糖苷酶染色与衰老蛋白p16检测结果显示，转染PINK1 siRNA后，其衰老程度加重；由于衰老细胞的功能远不如正常细胞，因而推测EPCs的功能也会有所减弱，随后通过CCK-8、Transwell和成血管实验，表明PINK1 siRNA组EPCs在增殖、迁移、成血管功能方面均有所降低，同时流式细胞仪也检测到胞内ROS水平升高。随后，我们通过透射电镜观察到PINK1 siRNA组细胞线粒体发生明显肿胀变形，自噬小体减少。LC3作为自噬过程中自噬泡形成的必要条件，主要由Ⅱ型LC3起主要作用，其锚定在自噬小体的膜上，通过与Ⅰ型LC3的比值可以衡量自噬活性。而p62作为评价自噬水平的常用标志，可以通过自噬降解自身，该蛋白积聚于胞质内表明自噬被抑制。通过Western blot检测线粒体自噬相关蛋白发现转染48 h与96 h后PINK1 siRNA组的PINK1、Parkin、LC3蛋白表达下调，而p62蛋白表达明显上调。以上结果表明细胞的衰老，细胞功能的降低，内源性ROS的产生，可能是由于PINK1的下调导致的，进而推测PINK1对EPCs衰老具有延缓作用，而这种延缓作用可能是通过其介导的线粒体自噬来实现的。同时，我们还通过比较不同转染时间各组细胞衰老和功能的变化，以证实EPCs在体外培养过程中随时间的延长，细胞衰老程度愈渐加重，功能明显减退。

综上所述，PINK1介导的线粒体自噬参与调节了EPCs的衰老和功能且起到了保护作用。这提示是否可以通过诱导PINK1介导的线粒体自噬来干预EPCs的衰老进程。但是由于自噬的发生是一把双刃剑，一方面自噬清除损伤的蛋白质和细胞器，可维持细胞的生存，而另一方面自噬过度反而会降低细胞的功能，诱发细胞的死亡；因此，如何通过把握自噬的“适度”原则来干预细胞衰老，还需进一步的深入研究。