乳酸杆菌产细菌素对金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌临床株的体外抑菌效果研究

柳青

40 年来,金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌是较常见的呼吸道致病菌,其生物学特征是以生物膜为主的侵袭人体［1］。球菌和链球菌大量存活在医院中,能导致严重的院内感染。近些年,肺炎链球菌已经是院内感染下呼吸道炎症最主要的致病菌之一。肺炎链球菌会导致长期间断发作的肺炎,其致病性和病死率均较高。即便大量输注抗生素,对其也不易形成有效抑制。研究人员发现,细菌导致的肺炎是在生物膜中进行的,是反复感染的原因所在［2］。因外院内获得性肺炎发病率高,其死亡率可有50%以上。所以,是否能发现一种耐药性较弱的药物,就是治疗该病的关键。之前,由于抗生素的大量使用可以很好地控制细菌繁殖,但是又有大量的过敏症状、逐渐增加的耐药性和肝肾功能损伤,限制了其持续使用。乳酸杆菌产细菌素是明显抑制细菌繁殖的蛋白质之一,而且细菌素对细菌载体无明显损伤,具有优良的生物稳定性,可以在肠道内直接吸收,不会产生蓄积作用,现在已经被越来越多的临床医师所注意。细菌素作为一种抗菌化合物,具有强烈抗菌活性,如革兰阳性和革兰阴性细菌。此次试验通过比较乳酸杆菌产细菌素抑制两种细菌的繁殖和干扰生物膜的功能,体现乳酸杆菌产细菌素对于治疗临床肺炎的重要意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2019 年1 月～2020 年12 月北部战区总医院中收治的40 例肺炎患者作为研究对象,痰液中分离培养出20 株金黄色葡萄球菌和20 株肺炎链球菌。

1.2试剂与仪器 选用保温的培养箱、菌落分析仪(法国BioMerieux 公司),VITEK-32 全自动微生物分析仪(法国生物梅里埃公司),旋转振荡器(上海皓庄仪器有限公司),-80℃低温培养箱(美国Thermo 公司),高压灭菌仪(宁波Runyes 公司),电子扫描显微镜(日本Nikon 公司),洁净操作台(美国Thermo 公司)。

1.3方法

1.3.1痰液标本采集 嘱患者早晨先用干净水清洁口腔,再使劲咳嗽,将气道深处的痰液咳出,留取第二次的痰液,放在无菌试管内保存,立即送检。把送来的痰液播撒在血琼脂表面,在低浓度氧气环境下(5%O2,10%CO2,85%N2)37 ℃培养24 h。再把细菌放置在VITEK-32 全自动微生物分析仪内经液化后放置在-80℃保存。试验时把两种致病菌放置在血琼脂上(37℃,6%CO2培养箱)培养24 h。

1.3.2乳酸杆菌产细菌素提取 把乳酸杆菌放置在血琼脂上培养24 h(37℃,6%CO2培养箱),乳酸杆菌从发酵物中提取。用分析仪调配浓度为3×108CFU/ml 的乳酸杆菌悬浊液。5 ml 乳酸杆菌悬浊液和95 ml 液体培养基(大豆蛋白粉、牛肉粉、发酵粉提供氮元素和其他营养物质；葡萄糖是可水解的糖类；磷酸氢二钾作为酸碱中和剂；柠檬酸三铵、硫酸镁、硫酸锰、吐温-80 和乙酸钠为可以产生各种生长因子,并干扰其他杂菌的生长；琼脂可固定悬浊液)搅拌后放置在37℃、6%CO2培养箱中,培养48 h,用离心机分离出混悬液的上清液,用0.22 μm 的生物膜把细菌过滤后提取其蛋白。再次放在离心机中压缩至1 ml,然后放在EP 管中,用4℃的清液进行封存。

1.3.3乳酸杆菌产细菌素对金黄色葡萄球菌及肺炎链球菌分离株的生长抑制作用 把金黄色葡萄球菌及肺炎链球菌都稀释为1.5×108CFU/ml 的混悬液后,实验组分别添加0.05 ml 金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的混悬液、0.1 ml 细菌素混悬液和2 ml BHI 液体培养基(用动物内脏浸入肉汤中生成的培养物通常简称BHI 培养基,主要保存各种难以生存的致病微生物,BHI 培养基是广泛使用的培养基,细菌、霉菌和发酵菌都可以繁殖)。操作过程中必须保持实验的公平性和合理性,所有操作都用移液枪转移混悬液。对照组的细菌素混悬液替换为生理盐水,所有标本都放置在37℃、6%CO2培养箱中培养24 h。

24 h 培养结束后取出试管充分震荡,提取0.1 ml的混悬液,将其浓度逐渐稀释至10-6倍,再取其中的0.05 ml 稀释后的混悬液平均播撒在血琼脂上,用37℃、6%CO2培养箱培养24 h,最后计算菌落总数(CFU)。根据公式：抑菌率(%)=(对照组细菌菌落总数-实验组细菌菌落总数)/对照组细菌菌落总数×100%,推算出抑菌率。

1.3.4乳酸杆菌产细菌素对金黄色葡萄球菌及肺炎链球菌分离株生物膜的作用 ①生成金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的生物膜：把金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌分别放置在血琼脂培养皿中,在37℃、6%CO2的培养箱中培养24 h,放置在酸碱中和液中,混合成1.5×108CFU/ml 的悬浊液,把盖玻片放置在无菌平皿中,实验组中放入9 ml BHI 液体培养基和含有0.1 ml 金黄色葡萄球菌或肺炎链球菌的混悬液,0.1 ml 的细菌素混悬液；对照组中放入9 ml BHI 液体培养基和0.1 ml 酸碱中和液,0.1 ml 金黄色葡萄球菌或肺炎链球菌的混悬液,全部放置在37℃、6%CO2的培养箱中保存24 h。②计算体外生物膜细菌个数：生物膜生成24 h 后移走盖玻片,进行充分剥离出粘附在表面的细菌后用酸碱中和液逐渐稀释到10-4倍,取出约0.05 ml 的混悬液平均播撒在血琼脂上,在37℃、6%CO2培养箱中培养24 h,计算菌落总数。根据公式：灭活率(%)=(对照组细菌菌落总数-实验组细菌菌落总数)/对照组细菌菌落总数×100%,推算出灭活率。

1.4统计学方法 采用SPSS20.0 统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差()表示,采用t 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1两组金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌菌落数比较实验组金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌菌落数分别为(3.41±0.91)×108CFU/ml、(4.81±1.21)×108CFU/ml,均低于对照组的(12.76±3.21)×108CFU/ml、(14.32±3.81)×108CFU/ml,差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 两组金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌菌落数比较(,×108 CFU/ml)

表1 两组金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌菌落数比较(,×108 CFU/ml)

注：与对照组比较,aP＜0.05

2.2乳酸杆菌产细菌素对不同细菌的抑菌率、灭活率比较 乳酸杆菌产细菌素对金黄色葡萄球菌的抑菌率为89.64%、灭活率为73.28%,均高于对肺炎链球菌的75.11%、66.41%。见表2。

表2 乳酸杆菌产细菌素对不同细菌的抑菌率、灭活率比较(%)

3 讨论

金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌是人类呼吸道的主要致病菌［3］。生物膜是许多微生物的基本结构,以此为特点的致病菌可导致许多感染疾病［4］。根据研究认为抗菌药物出现耐药性是生物膜的特殊功能导致的,因此,发现可靠消除生物膜的方法就成为临床探讨的重点。试验证实［5］,细菌素能抑制生物膜的形成,降低细菌的耐药性。此次试验中,乳酸杆菌中提取的细菌素对临床分离致病菌有很强的抑制作用,与金瑛等［6］和杨玉芳等［7］的试验结果相同。细菌素是一种兼具抗革兰阳性和阴性菌的化合物。所以细菌素可以对许多致病菌产生抗菌作用。金亮等［8］从生乳中分离,该菌株产生细菌,对革兰阳性菌和革兰阴性菌有活性,产生的抗菌物质对蛋白质溶解敏感,具有耐热性,对多种pH 有抗性。姜晶［9］在4℃和15℃的两种不同储存温度下,在乳酪繁殖的情况下检测透明乳杆菌2a的含量,并且在两种温度下抑制单个细胞基因的生长。张国强等［10］比较了在莱桑乳清中培养的30 株乳酸杆菌的抗真菌特性,发现了一种可以抗真菌的乳酸杆菌。匡珍等［11］从母乳喂养的婴儿粪便中提取出22 株乳酸菌BL-1,可明显抑制革兰阴性菌的生长。胡付品等［12］从酸菜中提取出4 株乳酸菌SD-22,对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有较强抗菌功能。乳酸杆菌通常被认为是安全的微生物,大部分细菌都是天然的,并且乳酸杆菌具有良好的热稳定性和对酸、盐和酶的耐受性。乳酸杆菌具有高效率、广泛和安全性的特点,可有效影响致病菌的生长。所以,探究乳酸杆菌所分泌的细菌素对致病菌的生长抑制作用,就显得尤为重要。

综上所述,乳酸杆菌产细菌素对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌的生长及生物膜都表现出较强的抑制作用,相比之下,对金黄色葡萄球菌的抑制作用更明显,可以体现乳酸杆菌产细菌素在临床上显著减轻肺炎症状的重要价值。