戟天健脑方介导CREB/BDNF通路调节低糖低氧条件下大鼠海马神经元细胞突触可塑性的机制研究❋

王添全， 欧阳竞锋， 荆志伟， 刘 蔚， 胡金涛， 曹俊岭， 郭明冬

(1.北京中医药大学中药学院， 北京 102488；2.中国中医科学院医学实验中心， 北京 100700；3.中国中医科学院学术管理处， 北京 100700；4.北京中医药大学附属东方医院， 北京 100078；5.北京中医药大学附属东直门医院， 北京 100700；6.中国中医科学院西苑医院， 北京 100091)

血管性痴呆(vascular dementia,VD)指由脑血管病变所致的严重认知功能障碍综合征，是最常见的非变性病痴呆，占痴呆患者的15%～20%[1]，其患者总数仅次于阿尔兹海默病。VD发病机制十分复杂，涉及神经递质水平变化、神经细胞凋亡、自噬、遗传、突触损伤、氧自由基损伤和炎症损伤等[2]，其中突触损伤日益受到关注。研究表明，在VD发病早期突触损伤就已存在，且不同程度的缺血缺氧也会导致突触超微结构的变化[3]。在短期脑缺血中仅少量树突会消失[4]，而长期的缺氧缺血则能迅速导致轴突和树突消融，突触数量减少，突触间隙也随之增宽[5]。VD突触损伤导致突触结构和功能破坏，使突触可塑性下降。课题组前期研究表明，戟天健脑方治疗轻度VD有良好效果[6]。本研究利用低糖低氧环境诱发大鼠海马神经元细胞神经突触损伤，观察戟天健脑方对突触可塑性的影响，及其对环磷酸腺苷应答元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)/脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)通路相关指标的调节作用，为进一步研究戟天健脑方的治疗机制奠定基础。本研究通过中国中医科学院西苑医院医学伦理委员会批准(批号2020XLC012-2)。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级SD乳鼠(出生72 h内)50只，6～8周龄雄性SD大鼠30只，体质量180～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号SCXK(京)2016-0006。乳鼠用于提取海马神经元细胞，大鼠用于制备含药血清。大鼠饲养在SPF级环境中，保持动物每日正常作息规律，自由进食饮水。

1.2 饮片与药物

戟天健脑方组成：酒茱萸12 g，远志10 g，红景天15 g，巴戟天12 g，茯苓20 g，由中国中医科学院西苑医院药剂科提供，经北京中医药大学东方医院药学部主任曹俊岭教授鉴定为正品；尼莫地平片(正大青春宝药业有限公司，国药准字H33022285，批号1901001)。

1.3 主要试剂及仪器

DMEM高糖培养基(货号11965-092)、DMEM低糖培养基(货号 11885-084)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS，货号10099-141)、谷氨酰胺(货号 25030-081)、青链霉素双抗(货号 15140-122)，美国gibco公司；突触素(synaptophysin，Syn,货号ab161606)、突触后膜致密物质95(postsynaptic density 95，PSD-95,货号ab18258)、突触生长相关蛋白43(growth-associated protein43，GAP-43,货号ab75810)、甲基CpG结合蛋白2(methyl CpG-binding protein 2，MecP2,货号ab50005)、三磷酸鸟苷酶活化蛋白(p250 GTPase activating protein，p250GAP,货号ab150847)、DAPI染色封片液(货号ab104139)，英国abcam公司；兔二步法检测试剂盒(货号PV-9001)、鼠二步法检测试剂盒(货号PV-9002)，北京中杉金桥生物科技有限公司；免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC(货号 P0186)、免疫荧光染色试剂盒-抗兔Alexa Fluor 555(货号 P0179)，上海碧云天生物科技有限公司；CREB ELISA检测试剂盒(货号36001)，美国Cell Signaling Technology公司；BDNF ELISA检测试剂盒(货号DBNT00)，美国Bio-techne公司；神经组织分离试剂盒(货号130-094-802)，德国Miltenyi Biotec公司。

R-210型旋转蒸发仪，瑞士步琦公司；6-16K型高速冷冻离心机，德国sigma公司；SynergyH1型多功能酶标仪，美国Biotek公司；SW-CJ-1FD型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；AE2000型倒置生物显微镜，厦门麦克奥迪光学仪器有限公司；371型恒温培养箱，美国Thermo公司；3131型三气培养箱，美国Thermo公司；130-096-427型自动恒温分离器，德国Miltenyi Biotec公司。

1.4 药液制备及溶液配制

1.4.1 戟天健脑方提取液制备 取戟天健脑方组方10剂共690 g，加8倍量水浸泡30 min煎煮1 h, 过滤收集药液，将残渣再次加5倍量水煎煮1 h收集药液。合并2次药液，减压旋转蒸发将药液浓缩至约575 mL，制备为药液浓度为1.2 g/mL的戟天健脑方提取液。

1.4.2 尼莫地平溶液制备 尼莫地平片每片20 mg，取5片研磨成粉末加去离子水至20 mL配成浓度为5 mg/mL尼莫地平溶液。

1.5 含药血清的制备

SD大鼠30只，适应性饲养1周后随机分为空白组、高剂量组、中剂量组、低剂量组及尼莫地平组、空白组10只，其余各组每组5只。按成人等效剂量计算出大鼠戟天健脑方的用药剂量为5 g/kg/d，则高剂量组为10 g/kg/d，低剂量组为2.5 g/kg/d，尼莫地平溶液给药剂量为50 mg/kg/d，空白组给等量0.9%氯化钠溶液。各组分别灌胃相应药物，每日1次共7 d，末次灌胃2 h后麻醉大鼠，腹主动脉取血，将所得血液在室温下静置 2 h，离心机设定4 ℃，离心半径15 cm，3000 r/min离心 10 min，取上清即为戟天健脑方高、中、低剂量含药血清，尼莫地平含药血清和空白血清。

1.6 大鼠海马神经元细胞的分离、培养

超净台内操作。选取出生3 d内清洁级SD大鼠，75%酒精对大鼠头、颈、上胸部进行消毒，断颈取头，固定头部，从中线剪开头部至嗅球，暴露大脑皮质，根据脑立体定位图谱分离出海马组织置于PBS溶液中，去除脑膜和脉络丛，用无菌眼科剪将海马组织剪块，试剂盒酶解。所得细胞转移至离心管中，离心后弃上清液，加入适量含10%FBS、1%L-谷氨酰胺、1%双抗(青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/mL)的 DMEM高糖培养基，吹打混匀制成单细胞混悬液，计数并调整细胞混悬液密度，于24孔板中放置细胞爬片并接种1 mL混悬液，使密度达4×105个/孔。常规(37 ℃、5%CO2和饱和湿度)条件下在培养箱中培养，每日观察细胞，至细胞覆盖率达到70%～80%，即得正常大鼠海马神经元细胞。

1.7 大鼠海马神经元细胞低糖低氧模型建立及干预

将海马神经元细胞分为空白组、模型组、阳性组、戟天健脑方高、中、低剂量组6组。吸去培养液，每孔加入1 mL含10%相应药物的含药血清。正常组培养条件保持不变，模型组培养基中加入空白血清，阳性组加入尼莫地平含药血清，戟天健脑方高、中、低剂量组加入相应剂量的含药血清。放入提前预温的培养箱(换为93% N2、5% CO2和2% O2混合气体，仍37 ℃、饱含湿度)中培养6 h，正常氧条件下恢复20 h。收集细胞上清液，加入4%组织固定液固定，取固定好的各组细胞进行HE染色以观察细胞形态变化。

1.8 观察指标及方法

1.8.1 各组细胞形态变化观察 取1.6项下已固定的细胞共6组，每组3个复孔，采用HE染色法进行染色。加入PBS缓冲液清洗3次后，加入苏木素染色后酸化返蓝，再加入1%伊红水溶液染色，脱水封片，使用数字切片扫描系统进行图片收集。

1.8.2 各组细胞中MecP2、p250GAP、PSD-95蛋表达 取1.6中已固定的细胞共6组，每组3个复孔，采用免疫组化二步法进行染色。用含0.025% TRITON-100的TBS溶液洗涤透化，5% BSA溶液常温封闭1 h，一抗孵育(PSD-95、MecP2、p250GAP抗体浓度均为1∶200)，4 ℃水平摇床上过夜，加相应二抗孵育1 h，DAB显色，苏木素复染，脱水封片，使用数字切片扫描系统扫描载玻片。使用Image J 1.53软件测算各指标阳性产物的光密度值(optical density，OD)。

1.8.3 各组细胞中GAP-43、Syn蛋白表达位点观察 取1.6项下已固定的细胞共6组，每组3个复孔，采用免疫荧光染色法。用含0.025% TRITON-100的TBS溶液洗涤透化，5% BSA溶液常温封闭1 h，一抗孵育(GAP-43、Syn抗体浓度均为1∶200)，4 ℃水平摇床上过夜，二抗改用荧光二抗(GAP-43使用Alexa Fluor 555红色荧光二抗、Syn使用FITC绿色荧光二抗，二抗浓度为1∶1000)避光孵育1 h，用含DAPI的明胶封片剂封片，使用数字切片扫描系统扫描载玻片。使用Image J 1.53测算平均灰度值(mean gray value)作为平均荧光强度。

1.8.4 各组细胞中CREB、BDNF含量 采用 ELISA法检测，按照说明书方法收集各组细胞上清及细胞裂解液，其中CREB含量使用细胞裂解液检测、BDNF含量使用细胞上清检测，按试剂盒说明书操作。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 细胞HE染色结果

图1示，HE染色结果显示，与空白组比较，模型组中细胞数量显著减少，细胞排列紊乱，细胞质轮廓模糊呈不规则形态，细胞核肿大松散甚至水解凋亡。与模型组比较，阳性对照组及戟天健脑方高、中、低剂量组细胞形态清晰，轴突细长明显，细胞核较为圆润，说明低糖低氧模型能损伤海马神经元细胞，而戟天健脑方具有一定保护作用。

注：C(Control)：空白组；Mo(Model)：模型组；P(Positive)：阳性组；L(Low)：戟天健脑方低剂量组；M(Medium)：戟天健脑方中剂量组；H(High)：戟天健脑方高剂量组图1 各组海马细胞形态观察比较(HE染色×200)

2.2 MecP2、p250GAP、PSD-95蛋白表达水平比较研究

图2表1示，各组细胞中MecP2、p250GAP、PSD-95蛋白表达水平，与空白组比较，模型组细胞中MecP2、PSD-95的表达明显减少，p250GAP的表达明显增加(P<0.05，P<0.01)。与模型组比较，阳性组及戟天健脑方高、中、低剂量组中MecP2、PSD-95蛋白表达均明显增加，p250GAP蛋白表达均明显减少(P<0.05，P<0.01)。

注：甲基CpG结合蛋白2(methyl CpG-binding protein 2，MecP2)；三磷酸鸟苷酶活化蛋白(p250 GTPase activating protein，p250GAP)；突触后膜致密物质95(postsynaptic density 95，PSD-95)；C(Control)：空白组；Mo(Model)：模型组；P(Positive)：阳性组；L(Low)：戟天健脑方低剂量组；M(Medium)：戟天健脑方中剂量组；H(High)：戟天健脑方高剂量组图2 各组细胞MecP2、p250GAP、PSD-95免疫组化染色结果(×200)

表1 各组细胞MecP2、p250GAP、PSD-95蛋白表达强度比较(OD值，

2.3 GAP-43、Syn蛋白表达位点比较研究

图3、4示，各组细胞中GAP-43、Syn蛋白表达，蓝色荧光为DAPI染色，主染细胞核；红绿荧光为二抗结合点，即蛋白表达位点。由合并(merge)图可以看出，红绿荧光主要分布在蓝色荧光周边，即GAP-43、Syn蛋白表达位点在核周突触位置。

注：突触生长相关蛋白43(growth-associated protein43，GAP-43)；C(Control)：空白组；Mo(Model)：模型组；P(Positive)：阳性组；L(Low)：戟天健脑方低剂量组；M(Medium)：戟天健脑方中剂量组；H(High)：戟天健脑方高剂量组；-B(Blue)：蓝色荧光通道；-R(Red)：红色荧光通道；-B-R：蓝红荧光通道合并(merge)图3 各组细胞GAP-43蛋白表达位点观察比较(免疫荧光染色×200)

注：突触素(synaptophysin，Syn)；C(Control)：空白组；Mo(Model)：模型组；P(Positive)：阳性组；L(Low)：戟天健脑方低剂量组；M(Medium)：戟天健脑方中剂量组；H(High)：戟天健脑方高剂量组；-B(Blue)：蓝色荧光通道；-G(Green)：绿色荧光通道；-B-G：蓝绿荧光通道合并(merge)图4 各组细胞Syn蛋白表达位点观察比较(免疫荧光染色×200)

表2示，各组细胞中GAP-43、Syn蛋白表达水平，与空白组比较，模型组细胞中GAP-43、Syn蛋白表达强度均明显降低(P<0.01)。与模型组比较，阳性组及戟天健脑方高、中、低剂量组中GAP-43、Syn蛋白表达均明显增加(P<0.05，P<0.01)，且随戟天健脑方剂量的提高，Syn蛋白表达也在增强。

表2 各组细胞GAP-43、Syn蛋白荧光表达强度比较

2.4 CREB、BDNF含量比较研究

表3示，与空白组比较，模型组细胞内CREB、BDNF含量均明显降低(P<0.01)；与模型组比较，阳性组及戟天健脑方高、中、低剂量组中CREB、BDNF含量均明显增加(P<0.05，P<0.01)。

表3 各组细胞中CREB、BDNF含量比较

3 讨论

VD属于中医学“痴呆”“呆病”等范畴，其发病机制与年老肾精亏虚、脑脉不充、痰浊瘀血阻窍密切相关。正如《医学心悟》所言：“肾主智，肾虚则智不足。”肾虚则易生痰，痰瘀互结、痰浊蒙窍则为痴呆。如《慎柔五书》载：曾有人病痴……此心系、脑络、脊髓之间有瘀痹之脉，阻其神机不能灵转也，此乃痰闭阳气之病。本病好发于中风病之后，中风形成的痰浊、瘀血等产物留于脑窍形成巢囊，影响脑神而致智能障碍,因此补肾化浊开窍是血管性痴呆的主要治法。

戟天健脑方由巴戟天、酒茱萸、红景天、茯苓、远志等组成。方中巴戟天补肾填精健脑，酒茱萸补肝益肾，涩精固脱，共为君药；茯苓健脾化浊宁神；远志化痰开窍安神益智，共为臣药，佐以红景天益气活血，解毒健脑，诸药合用补肾健脑，化浊开窍，神清智定。前期临床研究证实，戟天健脑方对轻度VD患者疗效确切，能显著改善患者的认知能力和日常生活状态，增加患者乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)及胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase，ChAT)活力，同时降低乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AchE)活性[7]。

CREB/BDNF通路在神经元保护与再生、突触形成及学习记忆改善等方面发挥着重要调节作用[8]。CREB能刺激基因转录，是一种转录增强因子，主要调节突触可塑性相关蛋白的合成，CREB在路径中既可正向抑制下游p250GAP蛋白合成，又可反向提高上游MeCP2蛋白表达，进而影响突触可塑性及学习记忆，在通路里具有承上启下的作用[9]。BDNF作为重要的神经生长因子之一，直接参与海马神经元的发生，维持神经细胞的生长与发育，是学习和记忆形成的基础。另外BDNF能促进突触可塑性相关蛋白的合成，其机制可能是通过上调丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2通路来提高CREB的表达[10]。CREB、BDNF既可以作为调控突触可塑性的重要因子，又能与多种靶基因或相关蛋白相互作用形成信号网络，调节突触形态变化和可塑性过程。本研究采用戟天健脑方干预低糖低氧条件下海马神经元细胞，结果显示模型组海马神经元细胞中CREB、BDNF含量大量减少，戟天健脑方各剂量组CREB、BDNF含量增加，说明戟天健脑方能够介导CREB/BDNF通路蛋白表达，从而参与大鼠海马神经元细胞损伤保护。MeCP2是甲基化结合蛋白的一种，可以特异性结合甲基化的DNA，作为通路的上游，MeCP2的增强可显著提高BDNF含量，促进神经元发育成熟、突触生长和可塑性调节[11]。p250GAP是CREB/BDNF通路的下游基因，参与底物的水解，水解后的底物又参与路径启动相关反应，p250GAP表达的抑制能够保证突触形态的稳定及正常的生长发育[12]。免疫组化结果显示，戟天健脑方可以使MeCP2表达增强，p250GAP表达减弱，二者作为CREB/BDNF通路的上下游蛋白，说明戟天健脑方对MeCP2，p250GAP的调控能够参与到CREB/BDNF信号通路中，发挥神经保护作用。

突触可塑性是指突触的形态和功能在长时间可调节的特性，反映出神经元对环境的适应以及发生功能性改变的能力。PSD-95主要位于突触后膜上，能够参与突触后膜上多种信号传递，与蛋白特异性结合参与突触可塑性的调节[13，14]。GAP-43作为突触前膜蛋白，参与神经细胞生长及突触发育形成和神经细胞损伤后再生，在神经元发育和再生过程中以高水平表达，发挥突触可塑性调节作用，是神经再生的特异性标志[15]。Syn不仅是突触前囊泡膜上固有的钙结合蛋白，与突触囊泡的释放密切相关[16，17]，还是突触前成分常用的标记物，参与突触结构的维持、神经的可塑性。其表达能够间接表现突触密度和数量，反映突触可塑性。本研究结果显示，戟天健脑方能增强以上突触相关蛋白表达，尤其是GAP-43及Syn蛋白，而模型组中各指标蛋白表达均明显减弱，说明戟天健脑方可以通过调节突触膜上相关特征蛋白来修复低糖低氧引起的大鼠神经元细胞损伤，其中以戟天健脑方高剂量的结果最为显著，具有一定的量效关系。综上所述，戟天健脑方可以通过激活CREB/BDNF通路调节低糖低氧条件下大鼠海马神经元细胞突触可塑性，其机制可能为通过调节MeCP2、p250GAP蛋白,提高CREB、BDNF含量，促进PSD-95、GAP-43及Syn蛋白表达，减缓突触损伤，保护神经元细胞。

本研究以“痴呆”病因病机和戟天健脑方临床治则为理论基础，探讨戟天健脑方对大鼠海马神经元细胞突触可塑性的影响，观察到戟天健脑方能有效减缓突触损伤，保护神经元细胞，并猜想与CREB/BDNF通路调节表达有关，为治疗血管性痴呆提供了新的思路。