2，4-表芸苔素内酯浸种对干旱胁迫下大麦种子萌发期淀粉代谢的影响

冯彩军，宋瑞娇，宋凌宇，张 松，齐军仓

(石河子大学 农学院，新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室，新疆 石河子 832003)

大麦作为一种栽培历史悠久的禾本科作物，因其环境适应性强，具有优良的食用、饲用和药用价值而被世界各地广泛种植。我国西南与西北地区是大麦的主要种植区，这些地区降雨少，经常遭受干旱的影响，尤其是在春季降水量相对较低，蒸散量较大，大麦播种期经常遭遇干旱胁迫，对种子萌发产生显著的不良影响，不止会延迟种子的萌发时间，还会降低种子发芽率，因此迫切需要寻找途径来解决干旱胁迫对大麦种子萌发、生长发育造成的不良影响。

芸苔素内酯是一种甾体激素，被认为是第6类植物激素，不仅能促进作物的生长和提高产量，还可以提高作物对各种非生物及生物胁迫的耐受性。2，4-表芸苔素内酯作为油菜素类固醇的类似物，已被证明可促进并维持抗氧化防御系统、光合作用和激素内环境稳定，以及增加渗透压和大量营养素积累，进而缓解低温、高温，以及盐和重金属胁迫对作物生长发育的抑制作用。虽然前人对芸苔素内酯在诱导植物抗旱性方面做了诸多研究，但在干旱胁迫下芸苔素内酯对大麦种子萌发影响的研究却比较少。

种子萌发是植物生命周期中非常脆弱的阶段，种胚是异养的，需要营养供给系统来维持生长，直到幼苗达到光合自养状态，在谷类作物中，这种供养系统主要是淀粉。大麦中含量最丰富的成分是淀粉，其比例为62%～77%。α淀粉酶和β淀粉酶是负责分解淀粉的主要酶。在萌发期间，α淀粉酶可在胚乳中动员淀粉，水解淀粉聚合物中的α-1，4-葡聚糖键，将直链淀粉转化为麦芽糖和葡萄糖(可溶性糖)。可溶性糖的产生与种子萌发呈正相关，同时，可溶性糖浓度的增加提高了植物对干旱、盐和极端温度等非生物胁迫的耐受性。在本研究中，我们用不同浓度的2，4-表芸苔素内酯处理大麦种子，测定种子的发芽率、根长、芽长、胚芽鞘长、胚根数、淀粉酶活性，以及淀粉、可溶性总糖、蔗糖、果糖、葡萄糖含量等指标，采用多个时间段动态分析其整个发芽过程，以期明确大麦种子萌发在干旱胁迫下对芸苔素内酯的生理响应机制，为解决大麦实际生产中在播种期遭遇干旱胁迫问题提供思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

粒大饱满、均匀一致的新啤6号大麦种子，2，4-表芸苔素内酯可溶性液剂(有效成分含量0.01%)。

1.2 试验设计

采用单因素随机区组设计，共设置7组处理(分别标记为CK、D、E、E、E、E、E)，每组设3次重复。将大麦种子用质量分数10% NaClO溶液消毒10 min，D、E、E、E、E、E处理分别用0、5、25、50、100、200 μg·L2，4-表芸苔素内酯溶液浸种24 h，期间隔12 h换1次新鲜的芸苔素内酯溶液，CK用蒸馏水浸种24 h，然后将浸泡过的种子整齐地摆放到铺有4层滤纸的发芽盒中，每盒摆放50粒种子。D、E、E、E、E、E处理发芽盒内分别加入40 mL的质量分数23%聚乙二醇-6000溶液(种子萌发半致死胁迫浓度)进行培养；CK处理发芽盒内加入40 mL蒸馏水进行培养。所有发芽盒置放到GZP-250A型智能人工气候培养箱(南京恒裕电子仪器厂)中，培养温度为25 ℃，光照时间为12 h。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 发芽率和根长、芽长、胚芽鞘长测定

在萌发72 h后，统计发芽情况，以胚根达到种子长、胚芽达到种子长度的一半作为种子萌发的指标。

发芽率(%)=72 h内能正常发芽的种子数/供试种子总数×100。

选取10株有代表性的大麦幼苗，用蒸馏水快速冲洗干净，统计根数，用直尺手动测量根长、芽长、胚芽鞘长。

1.3.2 淀粉酶活性测定

在种子萌发12、24、36、48、60、72 h，分别从发芽盒内选取10颗发芽种子，采用二硝基水杨酸测定还原糖的方法测定淀粉酶活性。测定过程中采用加热钝化β淀粉酶，测出α淀粉酶活性，再与非钝化条件下测定的总活性(α+β)比较，求出β淀粉酶的活性。酶活性定义为在40 ℃、pH值5.6条件下，1 min催化底物释放1 mg葡萄糖的量为1个酶活性单位(U)。

1.3.3 淀粉含量测定

选取萌发12、24、36、48、60、72 h的大麦种子，用蒸馏水将种子表面的聚乙二醇冲洗干净，60 ℃烘干，用磨样机粉碎，过60目筛(孔径0.3 mm)，称取0.1 g样品测定淀粉含量，测定方法参照文献[13]并略作修改。该方法测得的直链和支链淀粉含量均为相对于0.1 g样品的比例，总淀粉含量为支链淀粉含量和直链淀粉含量之和，均用百分比表示。

本试验用Hitachi U-5100紫外分光光度计对直链和支链淀粉的扫描液进行可见光全波段扫描得到吸收光谱，直链淀粉的测定波长λ为644 nm，参比波长λ为416 nm；支链淀粉的测定波长λ为538 nm，参比波长λ为766 nm；直链淀粉标准曲线：=0017 9-0112 5，=0.995 5；支链淀粉标准曲线：=0002 5+0002 76，=0.995 9。

1.3.4 可溶性总糖、葡萄糖、蔗糖、果糖含量测定

可溶性总糖、蔗糖和果糖含量的测定方法均参照文献[14]，葡萄糖含量用南京建成试剂盒(F006-1)测定。

1.4 数据分析

使用SPSS 25.0软件进行统计分析。用Duncan法进行多重比较，显著性水平为=0.05。采用Microsoft Excel 2010软件绘制图表，图、表中数据为平均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 芸苔素内酯对干旱胁迫下大麦种子萌发与幼苗生长的影响

由表1可见，干旱胁迫显著抑制了大麦种子萌发和萌发后幼苗的生长。与CK相比，干旱胁迫处理使大麦种子的发芽率显著降低，胚芽长、胚芽鞘长和胚根长均分别降低了78.56%、52.61%和71.53%，而根数量没有发生显著变化。与单独干旱胁迫相比，芸苔素内酯浸种处理下大麦种子发芽率表现出低浓度促进，高浓度抑制的趋势，5和25 μg·L芸苔素内酯均能显著提高干旱胁迫下大麦幼苗的发芽率，较单独干旱胁迫处理分别提高10.33、22.66百分点；且当浓度为5 μg·L时，芸苔素内酯对胚根长的促进作用非常明显，相较于单独干旱胁迫增加了0.81 cm，25和50 μg·L芸苔素内酯也对胚根长有一定的促进作用。5和25 μg·L芸苔素内酯对胚芽和胚芽鞘的长度有非常明显的促进作用，分别比单独干旱胁迫处理增加了15.57%、18.03%和28.97%、35.17%。相较于单独干旱胁迫处理，100和200 μg·L芸苔素内酯处理均会使大麦种子的发芽率降低，尤其是在200 μg·L芸苔素内酯处理下，胚芽鞘长、胚根长比单独干旱胁迫处理降低了19.31%和13.85%。

表1 芸苔素内酯对干旱胁迫下大麦种子萌发与幼苗生长的影响

2.2 芸苔素内酯对干旱胁迫下大麦种子萌发过程中淀粉酶活性的影响

由图1可见，大麦种子萌发的12～72 h，α淀粉酶、β淀粉酶和总淀粉酶活性均随萌发时间的延长而逐渐增加，与CK相比，干旱胁迫处理显著抑制了淀粉酶活性。萌发12 h，α淀粉酶活性非常低，但适宜浓度芸苔素内酯溶液处理依然可有效缓解干旱对α淀粉酶活性的抑制，萌发72 h时，α淀粉酶在5、25和50 μg·L芸苔素内酯处理下的活性分别为9.19、9.90、9.26 U·mg，与单独干旱胁迫处理相比分别增加了11.39%、19.95%、12.24%，差异均达到显著水平(<0.05)，而100、200 μg·L芸苔素内酯处理的α淀粉酶活性显著低于单独干旱胁迫处理(图1-A)。25 μg·L芸苔素内酯处理的β淀粉酶活性在萌发72 h时达到46.65 U·mg，显著高于除CK外的其他处理，然而，100和200 μg·L芸苔素内酯处理使种子β淀粉酶活性显著降低，比CK和单独干旱胁迫处理分别降低了32.68%、36.64%和10.37%、15.65%(图1-B)。萌发72 h，5、25 μg·L芸苔素内酯处理的总淀粉酶活性为51.82和56.55 U·mg，与CK相比分别降低了12.42%、4.42%，与单独干旱胁迫处理相比分别增加了18.61%、29.43%，差异均达到显著性水平(<0.05)，200 μg·L芸苔素内酯处理的总淀粉酶活性显著低于单独干旱胁迫处理(图1-C)。此外，在种子萌发的各时间段(除36 h)内，与单独干旱胁迫处理相比，α淀粉酶、β淀粉酶和总淀粉酶活性均在25 μg·L芸苔素内酯处理下显著提高，而200 μg·L芸苔素内酯处理下则降低。

数据以鲜重计。同一时期不同处理没有相同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Data was detected based on fresh weight. Data marked without the same lowercase letter in the same period indicated significant differences at P<0.05.The same as below.图1 芸苔素内酯对干旱胁迫下大麦种子α淀粉酶(A)、β淀粉酶(B)和总淀粉酶(C)活性的影响Fig.1 Effects of brassinosteroid on activities of α amylase (A)， β amylase (B) and total amylase (C) of barley seeds under drought stress

2.3 芸苔素内酯对干旱胁迫下大麦种子萌发过程中淀粉含量的影响

大麦种子萌发12～72 h，直链、支链和总淀粉含量呈持续降低的变化趋势，且干旱胁迫下种子的直链、支链和总淀粉含量均显著高于CK(图2)。与单独干旱处理相比，5、25和50 μg·L芸苔素内酯处理的支链淀粉含量在种子萌发的各时间段内(除36 h)均降低，在萌发72 h分别降低1.62、4.29、3.36百分点，差异均显著(<0.05)，而200 μg·L芸苔素内酯处理的支链淀则略高于单独干旱胁迫处理(图2-A)。种子萌发过程中，5、25和50 μg·L芸苔素内酯处理的直链淀粉含量均低于单独干旱处理，在萌发72 h分别降低0.62、1.18、1.94百分点，200 μg·L芸苔素内酯处理则与单独干旱胁迫处理相比没有显著差异(图2-B)。5、25和50 μg·L芸苔素内酯处理可使种子萌发各时间段内(除36 h)的总淀粉含量均低于单独干旱胁迫处理，在萌发72 h分别降低2.24、5.47、5.31百分点，差异均达到显著水平(<0.05)，而200 μg·L芸苔素内酯处理的总淀粉含量则比单独干旱胁迫处理升高粉含量0.71百分点(图2-C)。

图2 芸苔素内酯对干旱胁迫下大麦种子中支链淀粉(A)、直链淀粉(B)和总淀粉含量(C)的影响Fig.2 Effects of brassinosteroid on contents of amylopectin (A)， amylose (B) and total starch(C) in barley seeds under drought stress

2.4 芸苔素内酯对干旱胁迫下大麦种子萌发过程中糖含量的影响

由图3可见，随着大麦种子的萌发，可溶性总糖含量和葡萄糖含量呈逐渐增加的趋势。在种子萌发的12、24、36、48、60、72 h，单独干旱胁迫处理的大麦种子可溶性总糖含量比CK降低15.61%～57.43%，且差异显著(<0.05)，同时，25 μg·L芸苔素内酯预处理的大麦种子可溶性总糖含量在各时间段内都高于单独干旱处理。在萌发72 h时，5、25和50 μg·L芸苔素内酯预处理的大麦种子可溶性总糖含量分别比单独干旱处理高5.03%、8.77%和10.04%，而100、200 μg·L芸苔素内酯处理则显著低于单独干旱胁迫处理(图3-A)。与CK相比，干旱胁迫处理显著降低了种子萌发过程中的葡萄糖含量，在萌发各时间段内，适宜浓度(5、25和50 μg·L)的芸苔素内酯处理均促进干旱胁迫下葡萄糖含量的积累，而较高浓度(200 μg·L)芸苔素内酯处理的种子内葡萄糖含量均低于单独干旱胁迫处理(图3-B)。大麦种子萌发过程中，蔗糖含量先升高后降低，在正常条件(CK)下，36 h时达到最大值，而在干旱胁迫条件下，48 h时达到峰值；在种子萌发的各时间段内，25 μg·L芸苔素内酯预处理的蔗糖含量高于单独干旱处理，在萌发24、36、48、72 h，200 μg·L芸苔素内酯预处理的大麦种子蔗糖含量均低于单独干旱处理(图3-C)。在正常条件(CK)下，果糖含量呈先升高后降低的趋势，在干旱胁迫条件下，果糖含量没有随着萌发时间出现明显有规律的变化趋势，25 μg·L芸苔素内酯预处理的果糖含量除36 h外的其他各时间段内均高于其他处理，在萌发72 h，25和50 μg·L芸苔素内酯预处理的果糖含量分别比单独干旱处理高2.51%、1.74%，而200 μg·L芸苔素内酯预处理的果糖含量比单独干旱胁迫处理低4.15%(图3-D)。

图3 芸苔素内酯对干旱胁迫下大麦种子可溶性总糖(A)、葡萄糖(B)、蔗糖(C)、果糖(D)含量的影响Fig.3 Effects of brassinosteroid on the contents of soluble total sugar (A)， glucose (B)， sucrose (C) and fructose (D) in barley seeds under drought stress

3 结论与讨论

众所周知，干旱胁迫不利于种子的萌发和幼苗生长，本研究也证实了这一点，即正常条件下大麦种子的发芽率与幼苗生长状况明显优于干旱胁迫处理的种子。芸苔素内酯作为一种新型植物生长调节激素，其功能已在不同的非生物胁迫条件下被广泛研究，以增强各种作物的种子活力和促进幼苗生长。研究发现，芸苔素内酯浸种可提高盐胁迫下荞麦种子的发芽势、发芽率，缩短出苗所用时间和提高成苗率。此外，芸苔素内酯浸种对盐和干旱胁迫下棉花种子萌发的促进效应具有低浓度促进、高浓度抑制的趋势。在本研究中，芸苔素内酯处理对干旱胁迫下大麦种子的发芽率也同样表现出低浓度促进、高浓度抑制的作用，25 μg·L芸苔素内酯预处理时，干旱胁迫对大麦种子发芽率的抑制作用最小。Chon等用不同浓度的芸苔素内酯处理了9份水稻品种，发现适宜浓度芸苔素内酯溶液处理1周可促进所有水稻品种的中胚轴、胚芽鞘和叶鞘的伸长。本研究也得到了类似的结果，即在干旱胁迫下，经5、25 μg·L芸苔素内酯处理后的大麦种子，其芽长、胚芽鞘长和根长均高于单独干旱胁迫处理。然而，当芸苔素内酯的质量浓度升高至200 μg·L时，对上述指标均表现出明显的抑制作用。

种子萌发始于吸胀，并随着胚根和胚芽通过种皮突出而终止，这一过程需要的能量和物质主要通过淀粉代谢提供，α淀粉酶和β淀粉酶是淀粉水解过程中的关键酶。本研究发现，在大麦种子萌发的12～72 h，α淀粉酶、β淀粉酶和总淀粉酶活性呈持续上升趋势，这与王凤等的研究结果相似。干旱胁迫会显著抑制种子内α淀粉酶、β淀粉酶和总淀粉酶的活性，本研究得到了同样的结果。此外，本研究还发现，25 μg·L芸苔素内酯处理可使干旱胁迫下种子的α淀粉酶、β淀粉酶和总淀粉酶活性在萌发的各时间段内(除36 h)均显著高于单独干旱胁迫处理，而较高浓度(200 μg·L)的芸苔素内酯溶液处理则表现出相反的作用。郭秀璞等的研究也证明，较低浓度芸苔素内酯浸种处理的小麦种子在萌发时α淀粉酶活性提高，促进了小麦种子萌发和幼苗早期生长，而较高浓度的芸苔素内酯则没有表现促进效果。

植物在干旱条件下将淀粉降解为可溶性糖的能力可能对其在逆境下的生存和生长速度起着关键作用。本研究发现，大麦种子在12～72 h的萌发过程中淀粉含量逐渐减少，可溶性总糖和葡萄糖含量逐渐增加，蔗糖和果糖含量在萌发过程中呈现先上升后下降的趋势，这与黄升谋等和程昕昕等在小麦和玉米中的研究结果大体相符。陈蕾太等的研究表明，小麦种子萌发的0～72 h，干旱胁迫下种子的可溶性糖含量显著低于正常条件。本研究同样发现，干旱胁迫使大麦种子的可溶性总糖和葡萄糖含量显著低于正常条件，蔗糖含量在正常条件下萌发48 h就已达到最大值，而在干旱胁迫条件下萌发60 h时达到最大值，这可能与干旱胁迫抑制了糖代谢相关酶的活性有关，进而延迟了蔗糖含量达到最大值的时间。李钱峰等的研究发现，较高浓度芸苔素内酯处理使萌发水稻种子的淀粉保持着更好的结晶度和有序结构，使萌发过程中胚乳淀粉降解较慢，可能是导致种子萌发早期胚根生长缓慢的原因之一。在本研究中，较高浓度(200 μg·L)芸苔素内酯处理后的大麦种子含有较高的淀粉含量，而适宜浓度的芸苔素内酯(5、25 μg·L)处理则降低了干旱胁迫下种子萌发各时间段内的淀粉含量，并提高了可溶性总糖含量。这些结果与潘明洪等获得的结果类似，他们评估了亚精胺对干旱胁迫下白三叶种子淀粉代谢的影响。

综上所述，干旱胁迫下大麦种子萌发和幼苗生长受到显著抑制，淀粉酶活性显著降低，淀粉含量降低缓慢，可溶性糖含量降低。适宜浓度的芸苔素内酯处理可提高干旱胁迫大麦种子的萌发发芽率、芽和根的生长，提高种子内α淀粉酶、β淀粉酶和总淀粉酶活性，促使直链、支链和总淀粉含量下降，使种子萌发各时间段内的可溶性总糖、葡萄糖、蔗糖和果糖含量增加，而较高浓度的芸苔素内酯则对种子萌发和淀粉代谢表现出抑制作用。因此，在大麦生产实践中，对大麦种子进行5、25 μg·L2，4-表芸苔素内酯浸种处理，可促进大麦萌发期的淀粉代谢，提高大麦种子的发芽率，促进芽和根的生长。