超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中氧氟沙星残留量的不确定度评定

郑陆红，张慧琼，陈 茹

（1.广东省食品工业研究所有限公司，广东广州 511442；2.广东省食品工业公共实验室，广东广州 511442；3.广东省食品质量监督检验站，广东广州 511442）

氧氟沙星是一种人工合成抗菌药物，具有抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强和价格低廉等优点，被广泛应用于畜牧、水产等养殖业中水产动物的疾病预防与治疗[1-5]。氧氟沙星易残留于动物组织，通过食物链循环进入人体，形成耐药性，长期食用含有该药物残留的食品，可危害人类健康[6-7]。2015年我国农业部第2292号公告[8]规定水产品中不得使用氧氟沙星。近年来，国家市场监督管理总局食品安全监督抽检中关于食用农产品涉及的水产品项目中喹诺酮类兽药残留超标的通告较多[9-12]，其中氧氟沙星项目占据较大比例。因此，检测水产品中氧氟沙星药物的含量非常有必要。

食品检验过程会受到诸多不确定因素的影响，导致实验结果与真值之间存在一定的误差[13-14]。为了保证检测结果的准确性，真实反映被测量估计值的不确定度，需要对不确定度进行测量与分析。测量不确定度一般由若干个分量组成，表征赋予被测量值分散性的非负参数[15-16]。测量不确定度用于判断测量结果的可靠程度，检测过程中影响结果的不确定度来源及影响程度[17]。本文依据《化学分析中不确定度的评估指南》及《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[18-19]，结合《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》（农业部1077号公告—1—2008）对水产品中氧氟沙星残留量的不确定度进行测量与分析，评定测量不确定度[20]。通过对其进行不确定度评定，分析检测过程中的不确定度来源及各分量对实验结果的影响程度，为控制及减少实验过程中所产生的不确定度提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

水，一级水；甲醇、乙腈、醋酸铵和甲酸，均为色谱纯；无水硫酸钠（650 ℃灼烧4 h，冷却后贮于密闭容器中备用）；氧氟沙星标准品（CAS号：82419-36-1，纯度≥95.71%）；诺氟沙星-D5标准品（CAS号：1015856-57-1，纯度≥99.7%）；液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）；分析天平；涡旋混合器；超声波清洗仪；离心机；均质器；旋转蒸发仪等。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理过程

①称取5 g样品于50 mL离心管中，准确加入50 μL 诺氟沙星 -D5（1 μg·mL-1）内标标准工作液，涡旋混匀，避光放置10 min。②加入10 g无水硫酸钠，涡旋混匀，再加入20 mL甲酸-乙腈（1∶99）溶液，涡旋混合1 min，超声波提取10 min，离心，移取上清液。③残渣中再加入20 mL甲酸-乙腈（1∶99）溶液，重复提取1次。④合并两次提取液于40 ℃水浴中氮气吹干。⑤加1.0 mL 20%甲醇溶解残留物，再加入2.0 mL正己烷涡旋混合，转入5 mL离心管中，离心，取下层清液过0.22 μm滤膜后供UHPLCMS/MS分析测定。

1.2.2 标准工作液配制

氧氟沙星标准储备液：准确称取10.53 mg氧氟沙星，用乙腈溶解，并定容到10 mL容量瓶中，得到浓度为1 008 μg·mL-1的氧氟沙星标准储备液。

诺氟沙星-D5内标标准储备液：准确称取4.92 mg诺氟沙星-D5，用甲酸+甲醇（2+98）溶解，并定容到10 mL容量瓶中，得到浓度为491 μg·mL-1的诺氟沙星-D5内标标准储备液。

氧氟沙星标准中间液：吸取0.05 mL氧氟沙星标准储备液置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到浓度为1.008 μg·mL-1的氧氟沙星标准中间溶液。

诺氟沙星-D5内标标准中间液：吸取0.11 mL诺氟沙星-D5标准储备液置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到浓度为1.08 μg·mL-1的诺氟沙星-D5标准中间溶液。

氧氟沙星标准工作液：准确移取氧氟沙星标准中间液0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL和0.50 mL诺氟沙星-D5内标标准中间液于10 mL A级容量瓶中，用20%甲醇溶液定容至刻度，摇匀。氧氟沙星标准工作液浓度分别为 5.04 ng·mL-1、10.08 ng·mL-1、20.16 ng·mL-1、50.40 ng·mL-1和 100.80 ng·mL-1，诺氟沙星-D5内标浓度为54.0 ng·mL-1。

1.2.3 色谱条件

色 谱 柱：phenomenex-C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），柱温：40 ℃，流动相：A为0.1%甲酸水、B为甲醇，流速：0.3 mL·min-1，进样量：1 μL。梯度洗脱程序：0～0.50 min，90%A；0.50～5.00 min，90%A～ 10%A；5.00～ 6.00 min，10%A；6.00～6.01 min，10%A～90%A；6.01～7.00 min，90%A。

2 结果与分析

2.1 数学模型

样品中氧氟沙星残留量采用标准曲线法及同位素内标法定量，定量结果计算公式为

式中：X为试样中氧氟沙星的残留量，μg·kg-1；C为从标准工作曲线上得到的被测组分浓度，ng·mL-1；V为试样最终定容体积，mL；W为样品质量，g。

2.2 不确定度来源分析

超高效液相色谱-串联质谱法（Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UHPLC-MS/MS）测定水产品（鱼）中氧氟沙星残留量的不确定度来源主要有标准工作液配制过程中产生的不确定度、定容体积产生的不确定度、样品称量过程中产生的不确定度、样品进行重复测定产生的不确定度、最小二乘法拟合标准曲线产生的不确定度以及超高效液相色谱-串联质谱仪引入的不确定度等。

不同的因素及其影响见图1。

图1 UHPLC-MS/MS法测定水产品中（鱼）氧氟沙星的不确定度来源图

2.3 标准不确定度分量评定

2.3.1 配制标准工作液产生的相对标准不确定度urel,1(S)

（1）配制氧氟沙星标准物质引起的相对标准不确定度urel,2(P)。查阅氧氟沙星标准物质证书可知，其扩展不确定度为0.46%（k=2），纯度为95.71%，则其相对标准不确定度平方为[0.46%÷(2×95.71%)]2=5.775×10-6。

标准曲线所用内标溶液与试样溶液所用内标溶液为同一溶液且加入的量一致，因此配制诺氟沙星-D5内标溶液过程中称样量、稀释体积及纯度的不确定度的分量可忽略不计，只考虑内标溶液取样体积引入的不确定度。

（2）标准物质称量引起的相对标准不确定度urel,3(m1)。氧氟沙星标准物质是由十万分之一电子天平进行称量。根据电子天平检定证书，最大允许误差（MPE）为 ±0.05 mg，按矩形分布（）计算，称取氧氟沙星标准物质0.010 53 g，其相对标准不确定度平方为7.516×10-6。

（3）配制标准工作液配制过程中所用器具引起的相对标准不确定度urel,4(V1)。配制氧氟沙星标准工作液过程中所用器具引起的相对标准不确定度主要来源为容量瓶定容体积、移液枪移取溶液。配制所用的容量瓶经鉴定均为A级，可按国家规范《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）规定，按三角分布计算，移液器引入的相对标准不确定度，由校准证书得到，按三角分布计算，配制氧氟沙星标准工作液过程中所用器具的最大允许误差及相对标准不确定度的平方如表1所示。

表1 配制氧氟沙星标准工作液过程中所用器具引起的相对标准不确定度

配制氧氟沙星标准工作溶液配制过程中所用器量引起的相对标准不确定度的平方为=6.667×10-7+1.667×10-7+3.334×10-6+3.750×10-5+1.125×10-4+1.167×10-4=2.709×10-4。

（4）标准工作溶液配制过程中所用量器温度系数引起的相对标准不确定度分量urel,5(T1)。氧氟沙星标准工作液均在（20±4）℃条件下进行配制，溶液温度与检定标准温度（20 °C）不同产生了相对标准不确定度分量urel,5(T1)。可通过估算该体积膨胀系数和温度范围计算其引起的相对标准不确定度。液体的体积膨胀明显大于玻璃容器体积膨胀，故只考虑前者即可。乙腈的膨胀系数为1.37×10-3℃-1，甲醇的膨胀系数为1.19×10-3℃-1，水的膨胀系数为2.1×10-4℃-1，按照矩形分布计算，配制氧氟沙星标准工作液过程中，所用器具温度系数引起的相对标准不确定度的平方见表2。

表2 配制氧氟沙星标准工作液过程中所用器具温度系数引起的相对标准不确定度

配制氧氟沙星标准工作溶液时温度变化引入的相对标准不确定度的平方为)=1.002×10-5+7.553×10-6+1.176×10-6+7.553×10-6+7.056×10-7+1.647×10-6= 2.866×10-5。

综上，配制氧氟沙星标准工作液产生的相对标准不确定度的平方为=5.775×10-6+7.516×10-6+2.709×10-4+2.866×10-5=3.13×10-4。

2.3.2 样品前处理过程中产生的相对标准不确定度urel,6(Q)

（1）样品前处理过程中称量产生的相对标准不确定度urel,7(m)。通过查阅万分之一的电子天平使用说明书，称量5.000 0 g时，最大允差为0.5 mg，按矩形分布（），用该天平秤量样品6份，得到5 023.3 mg、5 061.5 mg、5 067.2 mg、5 077.0 mg、5 051.2 mg和5 061.3 mg，方差为342.4 mg，所用校准砝码引起的不确定度贡献较小，忽略不计。称取样品产生的相对标准不确定度的平方为=(342.4÷6)+(0.52÷3)=57.15 mg。

称取样品质量为5.023 3 g、5.061 5 g，其平均值为5.042 4 g，产生的相对标准不确定度的平方为

（2）样品处理过程中所用量器引入的相对标准不确定度urel,8(V3)。本方法采用内标法定量，样品前处理时使用1 000 μL移液枪移取400 μL诺氟沙星-D5内标（1.08 μg·mL-1）加入至样品中。使用 1 000 μL 移液枪移取1 000 μL 20%甲醇溶液进行定容。由于氧氟沙星含量超线性范围，样品定容后需再稀释8倍，使用200 μL移液枪取125 μL样液，加20%甲醇溶液定容至1.00 mL容量瓶。1 000 μL移液枪的最大容量允差为 ±10.0 μL，200 μL 移液枪最大允差为 ±3.0 μL，1 mL容量瓶的最大允差为±0.010 mL，依据三角分布，样品处理过程中所用器量产生的相对标准不确定度平方为

（3）温度系数引入的相对标准不确定度分量urel,12(T3)。样品是在（20±4）℃条件下进行定容，溶液温度与检定标准温度（20 °C）不同产生了相对标准不确定度分量urel,12(T3)。水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1，甲醇的膨胀系数为 1.19×10-3℃-1，按照矩形分布计算（）。内标中间液主要成分是甲醇，样品定容溶液和稀释液的主要成分是水，样品处理过程中温度系数产生的相对标准不确定度平方为

综上，样品前处理过程中产生的相对标准不确定度urel,6(Q)的平方为2.248×10-6+8.751×10-5+8.259×10-6=9.81×10-5。

2.3.3 样品重复性测定及标准曲线拟合产生的相对不确定度urel,17(C)

（1）样品测量结果重复性偏差产生的相对标准不确定度分量u(X)。选用一份阳性的样品，选取6份，经处理后，进行测定，测定结果见表3。

表3 样品重复性测定结果（单位：ng·mL-1）

（2）标准曲线拟合的标准偏差引入的相对标准不确定度。将氧氟沙星标准系列溶液测定3次，得到氧氟沙星与诺氟沙星-D5峰面积之比，取平均值。以氧氟沙星与诺氟沙星-D5的浓度之比X为横坐标，氧氟沙星与诺氟沙星-D5峰面积之比Y为纵坐标，进行回归分析。用最小二乘法拟合求出一元回归方程及相关系数，计算结果见表4。

表4 氧氟沙星标准系列溶液3次测定的结果

采用最小二乘法拟合浓度-峰面积之比的标准工作曲线，线性回归方程为y=4.169 4x-0.173；相关系数为r=0.999 9，大于0.995，符合《实验室质量控制规范食品理化检测》（GB/T 27404—2008）标准要求，说明氧氟沙星标准系列溶液浓度与诺氟沙星-D5标准系列溶液浓度之比和氧氟沙星标准系列溶液与诺氟沙星-D5标准系列溶液峰面积之比具有显著的线相关性。根据贝塞尔公式，标准曲线的剩余标准差SR为

式中：yij为氧氟沙星与诺氟沙星-D5峰面积之比；yi为回归直线计算的值；n为标准工作液的点数，n=5；m为标准工作液每个测量点重复测量次数，m=3。

（3）回归系数斜率a产生的不确定度u(a)的平方为

（4）回归系数截距b产生的不确定度u(b)的平方为

（5）仪器测量结果产生的不确定度。u(x)、u(y)、u(a)、u(b)之间相互独立不相关，根据公式：

氧氟沙星各分量灵敏系数为

合成标准不确定度uc(c)的平方为

样品重复性测定及标准曲线拟合产生的相对不确定度的平方为

2.3.4 超高效液相色谱-串联质谱仪引入的相对标准不确定度urel,18(I)

根据广东省计量科学研究出具的仪器校准证书，液相色谱-质谱联用仪引入的相对扩展不确定度Urel=10%，k=2，按照矩形分布得到仪器引入的相对标准不确定度的平方为

2.4 合成相对标准不确定度的评定ucrel(X)

根据含量计算公式，水产品（鱼）中氧氟沙星残留量测定的合成相对标准不确定度由标准工作液配制产生的相对标准不确定度、定容体积产生的相对标准不确定度、样品称量过程中所产生的相对标准不确定度、样品进行重复性测定产生的相对标准不确定度、标准曲线拟合产生的相对标准不确定度等分量组成，结果见表5。

表5 UPHLC-MS/MS法测定黄骨鱼中氧氟沙星含量测定的合成相对标准不确定度的分量

因此UHPLC-MS/MS法测定水产品（鱼）中氧氟沙星含量测定的合成相对标准不确定度为

2.5 扩展不确定度的评定

当样品中氧氟沙星的含量为 66.1 μg·kg-1，在95%置信区间，包含因子k=2，则其扩展不确定度为UP=kp×urel=2×3.78×6.1=5.0 μg·kg-1。

3 结论

当 样品中 氧氟沙星 含量为 66.1 μg·kg-1时，取置信水平p=95%（k=2），则其结果可以表示为（66.1±5.0）μg·kg-1（k=2）。通过计算合成相对标准不确定度可得知，UHPLC-MS/MS测定水产品（鱼）中氧氟沙星残留量的实验过程中各分量对实验结果影响程度的大小，为评定方法及结果的准确性提供了可靠的依据。相对于样品前处理过程中产生的相对标准不确定度，配制标准工作液引入的相对标准不确定度和仪器测量引入的相对标准不确定度对总合成相对标准不确定度影响较大。为了控制标准工作液配制工程中产生的误差，应使用高纯品的标准物质，检定合格的器具，定期对仪器进行校准。根据实际情况选择合适浓度的标准曲线范围，提高检验员人员的操作水平，减少操作过程引入的不确定度。