菖蒲郁金汤对帕金森病小鼠的神经保护作用及机制探讨

吴忧 朱虹 张厚文 徐彬 侯伯南 徐林胜 梁顺利

浙江中医药大学附属第二医院 浙江中医药大学第二临床医学院 杭州 310005

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是目前第二大神经系统变性疾病，随着人口老龄化进程的加剧，发病率仍在逐渐上升，严重威胁人类健康。目前PD临床治疗以药物为主，常用西药左旋多巴制剂等长期疗效不佳，而中医药具有天然、少毒、协同作用好等特点，在本病的长期防治中具有独特优势。PD的中医病机复杂，多数学者认为其以肝肾亏虚、气血阴阳不足为本，在本虚基础上形成了风、痰、火、瘀等病理改变[1]，因此熄风化痰、祛瘀通络法为PD常用的中医辨证治疗方法。菖蒲郁金汤为化痰祛瘀常用汤剂，适用于PD的中医治疗，但其作用机制尚不明确，限制了临床推广，因此目前在PD临床治疗中的应用相对较少。为此，本实验通过小鼠腹腔内注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）建立亚急性PD小鼠模型，采用菖蒲郁金汤进行干预治疗，评价菖蒲郁金汤对PD小鼠行为学症状、中脑黑质多巴胺能（dopamine，DA）能神经元的存活、纹状体神经元超微结构变化、神经元自噬活性以及α-突触核蛋白（α-synuclein，α-Syn）表达的影响，明确菖蒲郁金汤对PD小鼠的神经保护作用并探讨其相关机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级雄性C57BL/6小鼠36只，8～10周龄，体质量18～22 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005]，饲养于清洁级、正压屏障系统，12 h光照和黑暗交替，自由摄食和饮水，设施和饲料均来自浙江中医药大学动物实验中心[实验动物使用许可证：SYXK（浙）2021-0012]。本研究经浙江中医药大学实验动物管理与伦理委员会审批通过（伦理审批号：20180604-01）。

1.2 主要试剂及仪器 MPTP、小鼠抗酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）多克隆抗体均购于美国Sigma公司（批号：M0896、ab112）；兔抗微管相关蛋白1 轻链3B（microtubule -associated protein 1 light chain 3 Beta，LC3B）单克隆抗体购于美国Abcam公司（批号：EPR18709）；小鼠抗α-Syn单克隆抗体购于美国Santa公司（批号：sc-12767）；山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin，IgG）抗体、山羊抗小鼠IgG抗体均购于美国CST公司（批号：7074、7076）；鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗体购于杭州华安生物技术有限公司（批号：EM1101）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所（批号：P0012）。

RBMS-200C小鼠大脑冠状切片模具购于美国Kentscientific公司；RM2235切片机为德国Leica公司产品；Odyssey CLX激光成像仪购于美国Licor公司。

1.3 菖蒲郁金汤药物制备 由石菖蒲9 g，温郁金6 g，炒栀子9 g，牡丹皮9 g，鲜竹叶9 g，连翘6 g，灯心草6 g，木通4.5 g，淡竹沥15 g，玉枢丹1.5 g组成，药材来源于本院中药房。将石菖蒲、温郁金、鲜竹叶、炒栀子、牡丹皮、连翘、灯心草、木通以10倍的纯水浸泡，30 min后同煎，武火煎至沸腾，然后再用文火继续煎30 min，两煎后将余下的药渣另加5倍的纯水，再煎30 min，两次煎的药汁加入淡竹沥、玉枢丹冲泡，然后浓缩成浓度为2 g·mL-1的生药，装瓶压盖，真空包装储存备用。

1.4 PD动物模型制备及分组给药 参照文献[2]，按照以下方法制备小鼠亚急性PD模型：用0.9%氯化钠溶液将MPTP稀释至浓度为1 mg·mL-1，剂量为30 mg·kg-1，对小鼠进行腹腔注射，1次/d，共7 d。采用悬挂实验评价小鼠行为学症状，并取中脑黑质脑组织行TH免疫组化染色，观察DA能神经元存活情况。悬挂实验分数≤2分，且中脑黑质DA能神经元数目较正常对照明显减少，即为造模成功。

小鼠按照随机数字表法共分为正常对照组、MPTP模型组、菖蒲郁金汤组，每组12只。MPTP模型组和菖蒲郁金汤组按照上述方法建立PD模型，菖蒲郁金汤组在MPTP注射的同时开始给予20 g·kg-1菖蒲郁金汤生药灌胃，1次/d，共21 d。正常对照组给予30 mg·kg-1无菌0.9%氯化钠溶液腹腔注射，1次/d，共7 d。

1.5 行为学检测 最后1次给药结束后1、7、14 d，对各组小鼠进行下述行为学检测，检测均在上午9～12点进行，保证实验环境清洁。

1.5.1 爬杆实验 制作一长50 cm、直径1 cm的木杆，顶端放一木塞，小鼠放置在木塞上，计时1 min，然后将木塞倒立放置，小鼠自动向上爬行，测定记录小鼠的爬杆时间，每只小鼠共测3次，每次间隔时间30 min，取平均值为最终爬杆时间。

1.5.2 悬挂实验 将小鼠两前肢悬挂于水平电线上，若小鼠用两只后肢抓电线记3分，一只后肢抓电线记2分，两只后肢都不能抓电线记1分，小鼠直接落下记0分。

1.5.3 旷场实验 参照文献[3]方法制作实验旷场，先让小鼠在旷场内自由活动10 min，适应环境，随后将其放入旷场中央区域，记录小鼠在旷场内活动的总距离和活动平均速度，每只小鼠测定15 min。

1.6 标本采集 各组小鼠完成最后一次行为学检测后，采用0.3%戊巴比妥钠0.025 mL·g-1腹腔注射麻醉，穿刺左心室，以4 ℃的0.9%氯化钠溶液快速全身灌注，直至右心耳处流出的液体澄清。每组随机取8只小鼠，断头，取脑，置于冰上，应用脑冠状切片模具快速切取中脑处黑质部位脑组织（Bregma-2.8～-3.8），其中一半置于4%多聚甲醛中固定24 h，随后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，5 μm连续切片，4 ℃保存，后期进行免疫组化染色；另一半置于-80 ℃液氮中保存，后期进行免疫印迹法检测。每组剩下的4只小鼠，取约1 mm×1 mm×1 mm纹状体脑组织，2.5%戊二醛固定，常温保存，进行透射电镜检测。

1.7 TH免疫组化染色检测DA能神经元 取制备好的小鼠中脑黑质脑组织切片，采用水浴法进行抗原修复，室温条件下孵育，血清封闭，小鼠抗TH抗体按照1:500的比例进行稀释，然后滴加至切片上，4 ℃过夜，滴加二抗，室温条件下孵育，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，磷酸盐缓冲液返蓝后梯度乙醇中脱水，封片后光镜观察。观察黑质部位染色呈阳性的神经元，高倍镜下各组随机选取10个视野，计数TH染色阳性细胞数，并观察其形态变化。

1.8 透射电镜观察细胞超微结构 取制备好的小鼠纹状体脑组织块，磷酸盐缓冲液漂洗3次，1%的锇酸溶液中固定1～2 h，漂洗3次后梯度乙醇脱水，包埋剂梯度渗透，分装后包埋，70 ℃加热过夜，50～70 nm超薄切片，柠檬酸铅溶液染色15 min，醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液中染色15 min，透射电镜观察。

1.9 免疫印迹法检测自噬蛋白LC3B和α-Syn的蛋白表达 将冰冻组织分剪成碎片，以蛋白裂解液进行裂解，提取总蛋白，100 ℃条件下变性5 min，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），转至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，室温封闭2 h，分别加入α-Syn 抗体（稀释比例：1:200）、LC3B抗体以及内参蛋白抗体（稀释比例均为：1∶2 000），4 ℃过夜，滴加辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记二抗（稀释比例：1∶2 000），室温条件下孵育2 h 后，置于增强型化学发光试剂（enhanced chemiluminescence，ECL）工作液中，反应2 min后封闭，暗室内进行感光、显影和定影，分析蛋白条带，以GAPDH为内参，计算蛋白的相对表达量。

1.10 统计学分析 应用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析，计量资料以表示，各组间数据比较应用单因素方差分析，两组线性数据相关程度分析采用Pearson相关分析。以P＜0.05为有差异统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠行为学症状比较 与正常对照组比较，MPTP模型组小鼠1、7、14 d的爬杆时间均显著延长（均P＜0.01）。与MPTP模型组比较，菖蒲郁金汤组小鼠1 d时爬杆时间缩短（P＜0.05），7、14 d时爬杆时间进一步缩短（均P＜0.01）。与正常对照组比较，MPTP模型组小鼠1、7、14 d的悬挂实验分值均明显降低（均P＜0.01）。与MPTP模型组比较，菖蒲郁金汤组小鼠1 d时悬挂实验分值差异无统计学意义（P＞0.05），7、14 d时悬挂实验分值均增加（均P＜0.05）。与正常对照组比较，MPTP模型组小鼠1、7、14 d旷场实验活动总距离和平均速度均降低（均P＜0.01）。与MPTP模型组比较，各时间点菖蒲郁金汤组小鼠活动总距离和平均速度均显著增加（P＜0.01）。见图1。提示菖蒲郁金汤可明显改善PD小鼠的各种行为学症状。

图1 各组小鼠行为学测试结果Fig.1 Behavioral test results of mice in each group

2.2 各组小鼠中脑黑质DA能神经元存活情况比较TH免疫组化染色可见，MPTP模型组小鼠中脑黑质TH染色阳性神经元排列非常稀疏紊乱，胞质染色淡，突起明显细短。菖蒲郁金汤组小鼠中脑黑质TH染色阳性神经元排列相对密集有序，染色浓度较MPTP模型组深，突起变长。高倍镜下可见，MPTP模型组小鼠TH染色阳性神经元的数目较正常对照组显著减少（P＜0.01），菖蒲郁金汤组小鼠TH染色阳性神经元的数目较MPTP模型组显著增加（P＜0.01）。见图2。提示菖蒲郁金汤可增加PD小鼠中脑DA能神经元的存活。

图2 各组PD小鼠中脑黑质TH免疫组化染色情况（40×，标尺=50 μm）Fig.2 TH immunohistochemical staining of substantia nigra of PD mice in each group（40×，ruler=50 μm）

2.3 各组小鼠纹状体组织细胞超微结构比较 正常对照组小鼠纹状体神经元呈椭圆形，排列紧密，包膜构造较完整，胞内无蛋白聚集，线粒体膜结构完整，内嵴清晰可见。MPTP模型组神经元结构明显破坏，胞质水肿、空泡变性，核固缩变小，线粒体膜结构破坏，嵴模糊不清；菖蒲郁金汤组神经元部分结构破坏，胞质水肿、空泡变性现象较MPTP模型组减轻，线粒体膜结构相对完整，部分可见自噬溶酶体。见图3。

图3 各组小鼠纹状体电镜下细胞超微结构变化（醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染色，30 000×）Fig.3 Ultrastructural changes of striatum cells in each group under electron microscope（uranyl acetate-lead citrate double staining，30 000×）

2.4 各组小鼠中脑α-Syn以及自噬蛋白LC3B蛋白表达比较 与正常对照组比较，MPTP模型组和菖蒲郁金汤组中脑α-Syn蛋白表达均明显增加（P＜0.01）；与MPTP模型组比较，菖蒲郁金汤组α-Syn蛋白表达减少（P＜0.01）。见图4A、4C。

与正常对照组比较，MPTP模型组和菖蒲郁金汤组小鼠脑内微管相关蛋白1轻链3B-Ⅱ（microtubuleassociated protein 1 light chain 3 Beta-Ⅱ，LC3B-Ⅱ）/微管相关蛋白1 轻链3B-Ⅰ（microtubule-associated protein 1 light chain 3 Beta-Ⅰ，LC3B-Ⅰ）比值均增高（P＜0.01）；与MPTP模型组比较，菖蒲郁金汤组LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值则明显增高（P＜0.01）。见图4B、4D。

图4 各组小鼠黑质α-Syn和LC3B蛋白表达情况Fig.4 Protein expression of α-Syn and LC3B in substantia nigra of each group

2.5 PD小鼠中脑LC3B蛋白与α-Syn及DA能神经元存活的相关性 MPTP模型组和菖蒲郁金汤组LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ相对表达量与α-Syn蛋白相对表达量呈负相关（r=-0.825，P＜0.01），LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ相对表达量与中脑黑质DA能神经元存活数目呈正相关（r=0.756，P＜0.01）。见图5。

图5 LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ表达与α-Syn的蛋白表达、DA能神经元存活数的相关性Fig.5 Correlation of LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰexpression with α-Syn protein expression and surviving number of DA neurons

3 讨论

黑质致密区DA能神经元进行性死亡以及胞质内路易小体是PD的主要病理特征，异常聚集的α-Syn为路易小体的主要成分。PD患者的脑内存在自噬溶酶体途径障碍，研究认为这正是致使α-Syn出现异常聚集的重要原因，在PD的发病过程中起着关键作用[4-6]。近年来，激活自噬、恢复细胞的自噬溶酶体功能，从而促进脑内异常聚集α-Syn的清除，已成为治疗PD的一个新策略[7-8]，但目前尚缺少能基于此理论有效应用于临床的药物。中医药具有天然、少毒、协同作用强等特点，在PD的长期防治中有着很好的临床应用前景，研究表明多种中草药及其活性成分可通过抗炎、抗凋亡、抗氧化应激、激活自噬等途径治疗PD[9-11]。因此，基于PD的发病机制探寻有效的中药可能是解决PD治疗难题的一个方向。

中医认为，痰瘀机制在PD的病程发展过程中起着重要作用，化痰祛瘀法为PD常用的中医辨证治疗方法。菖蒲郁金汤为化痰祛瘀常用复方，出自《温病全书》，方中石菖蒲辛温，化湿痰、开窍；郁金辛寒，行气开郁；连翘配竹叶，轻清宣透，泄湿热邪气；木通配炒栀子、灯心草导湿热；竹沥苦寒，清化痰热而开其窍；牡丹皮行血脉，泻血中伏热；玉枢丹为成药，避秽化浊。诸药配伍具有辟秽化痰、解毒清热、醒脑开窍之效，适用于以痰瘀为主要病机的病症的治疗。有学者将石菖蒲、郁金与益智仁联用，治疗合并智能减退的PD患者，认为此法可扶脏腑之本，治痰瘀之标，上下同治，具有良效[12]。本研究结果表明，菖蒲郁金汤可以改善PD小鼠的运动功能障碍，增加中脑DA能神经元的存活，由此明确了菖蒲郁金汤对PD具有神经保护作用。

中医理论认为，精微物质滞留体内，五脏不能运化，日久则为痰瘀，现代医学中破损的细胞器、异常聚集的蛋白质等病理性代谢产物，皆属于中医中的痰瘀之邪。细胞自噬程序可清除降解病理产物，自噬障碍则会导致痰瘀聚集，PD中α-Syn的异常聚集则是痰瘀聚集的具体表现。化痰祛瘀中药治疗PD很可能是通过增强自噬的机制来实现。研究表明，石菖蒲挥发油的主要成分β-细辛醚可减少α-Syn聚集，保护PD大鼠中脑神经元免受损伤[13]，可能通过调节内质网应激自噬的机制发挥作用[14]。前期研究证实，石菖蒲和郁金的主要单体成分姜黄素可有效改善PD小鼠的行为学症状，减轻PD细胞损伤，激活自噬，促进α-Syn的清除是其发挥对DA能神经元保护作用的主要机制[15-16]。基于此，本研究进一步探讨了菖蒲郁金汤用于治疗PD的可能机制。自噬特异蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值是目前公认的自噬活性评价指标[17]，本研究发现，菖蒲郁金汤干预后，PD小鼠中脑黑质自噬蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值增加，且PD小鼠的LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值与α-Syn表达呈负相关，与DA能神经元的存活数呈正相关，提示菖蒲郁金汤增强了中脑黑质神经元自噬活性，且增强的自噬活性有效促进了α-Syn的清除，减少了DA能神经元的损伤。

黑质-纹状体通路是PD运动调节的重要通路，近期研究发现，一种富集于纹状体的Ras同源蛋白（the Ras homolog enriched in striatum，Rhes）可通过调节纹状体自噬，而影响PD小鼠的运动障碍，可能成为PD治疗的一个药理靶点[18]，因此本研究进一步通过电镜观察了纹状体超微结构变化和自噬溶酶体情况，结果显示菖蒲郁金汤治疗后纹状体神经元损伤减轻，同时胞质内自噬溶酶体也增多，提示菖蒲郁金汤还可保护纹状体神经元，增强其自噬活性。

综上所述，菖蒲郁金汤可改善PD小鼠的行为障碍，对PD的DA能神经元具有保护作用，增强神经元自噬活性，从而促进α-Syn的自噬性清除是其主要作用机制之一。作为化痰祛瘀常用复方，菖蒲郁金汤在PD的长期防治中有较大的潜力，但目前相关的机制研究非常有限，限制了其临床推广，该复方通过何种通路或途径调节自噬等具体机制期待今后更深入研究予以探讨。