CircPCSK5 在胃癌中高表达并促进胃癌细胞的增殖、侵袭和上皮间质转化

左学良，蔡 娟，陈志强，李艳娜，张斗峰

皖南医学院第一附属医院（弋矶山医院）1胃肠外科，2重大疾病非编码RNA 转化研究安徽普通高校重点实验室，3肿瘤内科，安徽 芜湖 241001；4南京医科大学第一附属医院肝胆中心，江苏 南京210029

全球胃癌发病率和死亡率分别居所有恶性肿瘤的第5位和第4位，每年新发病例数近109万，约44%发生在中国［1］。早期胃癌缺乏特征性临床表现，大多患者确诊时已处于进展期。我国胃癌总体预后较差，转移仍然是其主要死亡原因［2］。因此，深入探讨胃癌侵袭转移的发生机制、挖掘新的治疗靶点对提高患者生存率有重要研究意义。

环状RNA（circRNA）已被证实能在多层面调控肿瘤增殖、侵袭转移、上皮间质转化（EMT）、免疫逃逸以及代谢重编程等生物学行为，进而影响肿瘤的发生发展［3,4］。既往研究报道circ_0058106通过调控Wnt2b/βcatenin/c-Myc通路，促进下咽鳞状细胞癌的增殖、侵袭转移和EMT［5］。Circ-CPA4以竞争性内源RNA机制吸附let-7，上调PD-L1表达，促进非小细胞肺癌免疫逃逸［6］。本课题组前期研究也发现circHECTD1可通过调控βcatenin/c-Myc信号通路促进胃癌谷氨酰胺代谢重编程和肿瘤进展［7］；circRHBDD1能促进肝癌细胞糖酵解和肿瘤进展并降低肿瘤对PD-1抑制剂的应答率［8］。

在本研究中，我们对3对胃癌组织和癌旁正常胃粘膜组织进行高通量测序，发现一个新的环状RNA circPCSK5在胃癌组织中表达显著升高，目前对其功能尚未有文献报道。本文探讨circPCSK5在胃癌中的表达和功能情况，为胃癌的转移预测和预后判断提供理论依据。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选取2018年4月～2019年4月在我院行胃癌根治术的患者共62例，其中男性50例，女性12例，中位年龄63岁，收集患者的组织标本和临床病理资料。本研究患者纳入标准：术后病理确诊为胃腺癌；临床病理资料完整；患者依从性好，所有患者均签署知情同意书。排除标准：术后病理证实为非腺癌或合并其他病理类型；合并其他部位恶性肿瘤；非根治性切除；合并血液、自身免疫性疾病和精神类疾病等。所有患者术前均未接受化疗、放疗、靶向或免疫治疗。术后对这些患者进行定期电话或门诊随访，记录患者疾病状态和生存情况，随访时间从手术日期至2022年3月31日，中位随访时间26月。本研究经皖南医学院第一附属医院（弋矶山医院）伦理委员会批准（2018伦审研105号）。

1.2 细胞和实验试剂

人正常胃粘膜上皮细胞GES-1、人胃癌细胞MKN45、MKN28、AGS 和HGC27（中国科学院上海细胞库）。RPMI 1640培养基、10%胎牛血清、青-链霉素、磷酸缓冲盐溶液（PBS）和胰蛋白酶（Gibco），RNase R 试剂（Epicentre Technologies），Actinomycin D（Sigma-Aldrich），LipofectamineTM3000、TRIzol 试剂和PARISTM试剂盒（Invitrogen），反转录和实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）试剂盒（TaKaRa），circPCSK5的siRNA、过表达质粒和RNA 荧光原位杂交（FISH）试剂盒（上海吉玛制药技术有限公司）。CCK-8试剂（日本同仁化学研究所），Transwell小室（Corning），Matrigel基质胶（BD）。BCA试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH和辣根过氧化物酶偶联二抗（Cell Signaling Technology），ECL化学发光超敏显色试剂盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司]。

1.3 实验方法

1.3.1 circRNA测序 用TRIzol试剂提取3对胃癌及癌旁正常胃粘膜组织总RNA，质检合格后委托广州锐博生物技术有限公司进行高通量测序。

1.3.2 细胞培养和转染 利用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基，将细胞置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。在胃癌细胞中利用LipofectamineTM3000转染circPCSK5的siRNA和过表达质粒，48 h后通过RT-qPCR检测circPCSK5的表达水平。circPCSK5的siRNA序列为：si-circPCSK5#1:5'-AGUCCUACGAUAAGGCAUGTT-3'，si-circPCSK5#2:5'-CUACGAUAAGGCAUGGGACTT-3'。

1.3.3 RT-qPCR实验 通过TRIzol法提取组织和细胞总RNA，利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板，GAPDH或U6为内参，按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书进行PCR实验，利用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成（表1）。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR

1.3.4 环状RNA 稳定性检测 提取细胞总RNA，经RNase R 消化后，利用RT-qPCR检测circPCSK5 和PCSK5 mRNA的表达水平。细胞经actinomycin D处理0、4、8、12、24 h后，提取细胞总RNA，利用RT-qPCR检测circPCSK5和PCSK5 mRNA的表达水平。

1.3.5 FISH实验 按照RNA FISH试剂盒说明书进行，以2×105细胞/孔接种于共聚焦小皿，4%多聚甲醛室温固定10 min，0.1%TritonX-100细胞通透5 min。加入circPCSK5探针混合液，置于37 ℃培养箱中避光杂交过夜。次日利用杂交洗液洗涤3次，5 min/次。加入DAPI染色液染色10 min，PBS洗涤后于共聚焦荧光显微镜下观察并拍照。

1.3.6 细胞核质分离实验 按照PARISTM试剂盒说明书提取细胞核和细胞质RNA，裂解细胞后离心，上清液含细胞质RNA，沉淀含细胞核RNA，利用过滤柱对RNA清洗纯化并进行RT-qPCR检测。

1.3.7 CCK-8实验 将circPCSK5的siRNA或过表达质粒转染48 h后的胃癌细胞按照1×103个/孔的密度接种于96孔板，加入100 μL培养基分别培养1、2、3、4、5 d，每天在同一时间点加入10 μLCCK-8试剂，置于细胞培养箱中避光温育2 h，用酶标仪检测各孔的吸光度值A450nm。

1.3.8 EdU实验 质粒转染48 h后，按5×104细胞/孔接种到24 孔板上，用4%多聚甲醛固定30 min，0.5%TritonX-100溶液通透10 min后进行细胞固定、EdU染色和DNA染色，在荧光显微镜下拍照并计算增殖细胞百分比。

1.3.9 Transwell实验 质粒转染48 h后，用含250 μL无血清培养基将2×104个细胞置入预铺Matrigel基质胶的transwell上室，在下室中加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，培养36～48 h后，用4%多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染色10 min，在显微镜下拍照并计数，观察细胞侵袭能力。在transwell上室中不预铺Matrigel基质胶，按照同样方法进行实验，观察细胞迁移能力。

1.3.10 Western blot 实验 裂解细胞提取总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，各组取等量蛋白进行SDSPAGE，再电转至PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭2 h，加入按比例稀释的E-cadherin、Ncadherin、Vimentin和GAPDH一抗，4 ℃温育过夜。第2天加入辣根过氧化物酶偶联二抗，室温孵育2 h，用超敏ECL化学发光试剂盒显色并曝光。

1.4 统计学处理

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。两组间计数资料采用χ2检验，计量资料采用独立样本t检验。Kaplan-Meier曲线和log-rank检验用于比较患者生存差异，Cox比例风险回归模型用于多因素生存分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌和癌旁组织circRNA高通量测序分析

对3对胃癌和癌旁正常胃粘膜组织进行高通量测序，差异表达circRNA在人类染色体的分布见图1A，图1B显示circRNA的junction reads数目。测序结果提示98.7%差异表达circRNA来源于外显子（图1C）。对差异表达circRNA 的亲本基因进行Kyoto encyclopedia of genes and genomes（KEGG）通路富集分析，结果发现Metabolic pathway、Epstein-Barr virus infection 和Pathway in cancer等通路存在显著富集（图1D）。Gene Ontology（GO）功能富集分析主要从分子功能、细胞组分和生物过程3个层面进行。在分子功能层面，差异基因主要富集于binding、protein binding和catalytic activity等功能；在细胞组分层面，差异基因主要富集于cell part、cell和intracellular等组分；在生物过程层面，差异基因主要富集于cellular process、single-organism process和single-organism cellular process等过程（图1E）。

图1 胃癌和癌旁组织circRNA高通量测序分析Fig.1 Analysis of high-throughput sequencing of GC and adjacent normal tissues.A:Circos plot of circRNAs in human chromosomes.B: Junction reads of circRNAs.C: Pie chart of circRNA classes.D: KEGG pathway enrichment of the parental genes of the differentially expressed circRNAs.E:GO analysis of the parental genes of the differentially expressed circRNAs.

2.2 CircPCSK5是一个高通量测序新发现的环状RNA

通过高通量测序构建胃癌和癌旁组织中circRNA差异表达谱（图2A），我们筛选了在测序结果中表达上调排名前五circRNA（表2），并在20对胃癌和癌旁组织中验证其表达水平，结果显示hsa_circ_0087234 在胃癌组织中表达上调最为明显（图2B），因此我们将hsa_circ_0087234作为研究对象。circBase数据库检索结果提示hsa_circ_0087234由PCSK5基因的6、7、8和9号外显子反向剪接形成，我们将其命名为circPCSK5（图2C）。Sanger测序验证了circPCSK5接头处的成环序列（图2D）。利用oligo-dT引物的RT-qPCR检测结果表明circPCSK5缺少poly（A）尾（图2E、F）。经RNase R消化细胞后，RT-qPCR结果显示circPCSK5较PCSK5 mRNA表达升高（图2G、H）。利用actinomycin D处理细胞，在不同时间点利用RT-qPCR检测circPCSK5和PCSK5 mRNA表达，结果显示circPCSK5比线性mRNA更稳定（图2I、J）。FISH和细胞核质分离实验结果显示circPCSK5 主要位于胃癌细胞的细胞质（图2K～M）。检测62例胃癌组织中circPCSK5的表达水平，按照中位数分为circPCSK5高表达和低表达组，分析circPCSK5 表达与患者临床病理变量的相关性，结果提示circPCSK5 高表达与肿瘤大小（P=0.004）、脉管侵犯（P=0.022）、淋巴结转移（P=0.010）和AJCC 分期（P=0.011）存在明显正相关（表3）。

表3 胃癌组织中circPCSK5表达水平与患者临床病理特征的相关性Tab.3 Relationship between circPCSK5 expression levels and clinicopathological features of gastric cancer patients (n=62)

图2 CircPCSK5是一个高通量测序新发现的环状RNAFig.2 CircPCSK5 is a novel circular RNA identified by high-throughput sequencing.A:Heat map of differentially expressed circRNAs in GC and adjacent normal tissues.B:RT-qPCR for assessing the top 5 upregulated circRNAs identified in high-throughput sequencing.C:circBase database indicates that circPCSK5 is generated from exons 6-8 of the PCSK5 gene through a back-splicing mechanism.D:Sanger sequencing analysis showing the back-splicing site of circPCSK5.E,F: RT-qPCR for circPCSK5 and PCSK5 mRNA using the template cDNA reverse-transcribed by random primers and oligo dT primers in HGC27 cells(E)and MKN45 cells(F).G,H:RT-qPCR for expression of circPCSK5 and PCSK5 mRNA in HGC27 cells (G) and MKN45 cells (H) treated with RNase R.I,J: RT-qPCR for circPCSK51 and PCSK5 mRNA in HGC27 cells(I)and MKN45 cells(J)treated with actinomycin D at the indicated time points.K:FISH assay for determination of the subcellular distribution of circPCSK5 in HGC27 and MKN45 cells(×200).L,M:Abundance of circPCSK5 from separated nuclear and cytoplasmic fractions detected by RT-qPCR in HGC27 cells(L)and MKN45 cells(M).***P＜0.001.

表2 高通量测序表达上调前五环状RNATab.2 Top 5 upregulated circRNAs in GC identified in high-throughput sequencing

2.3 CircPCSK5在胃癌中高表达

在62例患者的胃癌组织和癌旁正常胃粘膜组织中，通过RT-qPCR进一步检测circPCSK5的表达水平，结果显示胃癌组织中circPCSK5的表达明显升高（P＜0.001，图3A）。并且，circPCSK5在胃癌细胞系MKN45、MKN28、AGS和HGC27中表达较正常胃粘膜细胞系GES-1显著升高（图3B）。亚组分析结果显示在伴有淋巴结转移患者和AJCC分期III期患者中circPCSK5表达更高，差异均有统计学意义（P＜0.001，图3C、D）。

图3 CircPCSK5在胃癌中高表达Fig.3 CircPCSK5 expression is upregulated in GC tissues and cell lines.A:Expression levels of circPCSK5 in 62 paired GC and adjacent normal gastric mucosa tissues detected by RT-qPCR.B:Expression levels of circPCSK5 in GC cell lines and normal human gastric cell line GES-1 determined by RT-qPCR.C:CircPCSK5 expression levels in lymph node metastasis positive group and negative group.D: CircPCSK5 expression levels in AJCC stage I-II group and the stage III group.**P＜0.01,***P＜0.001 vs GES-1.

2.4 CircPCSK5高表达预示胃癌患者不良预后

对纳入的62例胃癌患者进行随访，Kaplan-Meier生存曲线结果显示，胃癌组织中circPCSK5高表达的患者具有更短的总生存时间（图4A）和无病生存时间（图4B），差异均有统计学意义（P＜0.001）。单因素生存分析结果显示，肿瘤大小≥5 cm、脉管侵犯、淋巴结转移、AJCC分期Ⅲ期、circPCSK5高表达与胃癌患者总生存和无病生存相关（表4、5）。将单因素分析中有统计学意义的变量纳入Cox多因素回归分析，结果表明淋巴结转移、AJCC分期Ⅲ期、circPCSK5高表达是胃癌患者总生存和无病生存的独立危险因素（表4、5，图4C、D）。

图4 CircPCSK5高表达与胃癌患者不良预后相关Fig.4 High expression of circPCSK5 is associated with an unfavorable prognosis of GC patients.A,B:Kaplan-Meier analysis of the correlation of circPCSK5 expression with overall survival and disease-free survival.C,D:Cox proportional hazards regression analysis showing the independent risk factors for overall survival and disease-free survival.

2.5 敲低circPCSK5表达能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭

利用siRNA敲低circPCSK5表达，RT-qPCR结果显示si-circPCSK5#1 的敲低效率最显著，且不影响PCSK5 mRNA的表达水平（图5A）。CCK-8和EdU实验结果表明si-circPCSK5#1 组细胞的增殖能力明显受抑制（P＜0.01，图5B、C）。Transwell 实验结果显示sicircPCSK5#1组细胞的迁移和侵袭能力较si-NC组显著降低（P＜0.001，图5D）。

图5 敲低circPCSK5能抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭Fig.5 CircPCSK5 knockdown suppresses the proliferation,migration and invasion of GC cells.A:RT-qPCR analysis of circPCSK5 and PCSK5 mRNA in HGC27 cells after transfection with two siRNAs targeting circPCSK5.B:Proliferation of HGC27 cells after circPCSK5 knockdown detected by CCK-8 assay;C:EdU assay for examining the effect of circPCSK5 knockdown on HGC27 cell proliferation(Original magnification:×100).D:Migration and invasion of HGC27 cells after circPCSK5 knockdown examined by Transwell assay(×100,crystal violet staining).**P＜0.01 vs si-NC group,***P＜0.001 vs si-NC group.

2.6 过表达circPCSK5能够促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭

在MKN45细胞中转染circPCSK5的过表达质粒，RT-qPCR验证转染效率（图6A）。CCK-8实验和EdU实验结果表明过表达circPCSK5能够促进胃癌细胞的增殖能力（P＜0.01，图6B、C）。Transwell实验结果表明过表达circPCSK5组细胞的迁移和侵袭能力较对照组明显提高（P＜0.001，图6D）。

图6 过表达circPCSK5能促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭Fig.6 CircPCSK5 overexpression promotes proliferation,migration and invasion of GC cells.A: Overexpression efficiency of circPCSK5 was determined using RT-qPCR in MKN45 cells.B: Proliferation of MKN45 cells with circPCSK5 overexpression detected by CCK-8 assay.C:EdU assay for examining the effect of circPCSK5 overexpression on MKN45 cell proliferation(×100).D: Migration and invasion of MKN45 cells with circPCSK5 overexpression examined by transwell assay (×100,crystal violet staining).**P＜0.01,***P＜0.001.

2.7 CircPCSK5对胃癌细胞EMT的影响

利用Western blot和RT-qPCR方法检测EMT标记物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达变化。结果显示：与对照组相比，circPCSK5敲低组细胞中上皮细胞标记物E-cadherin表达显著升高，间质细胞标记物N-cadherin 及Vimentin 的表达明显降低（P＜0.01，图7A、B），而过表达circPCSK5后E-cadherin表达下降，Ncadherin及Vimentin的表达升高（P＜0.01，图7C、D）。

图7 CircPCSK5对胃癌细胞EMT的影响Fig.7 Effect of circPCSK5 knockdown and overexpression on EMT of GC cells.A:Expression of EMT markers in HGC27 cells after circPCSK5 knockdown detected by Western blotting.B:RT-qPCR for expression of EMT markers in HGC27 cells after circPCSK5 knockdown.C:Expression of EMT markers in MKN45 cells with circPCSK5 overexpression detected by Western blotting.D: RT-qPCR for expression of EMT markers in MKN45 cells with circPCSK5 overexpression.**P＜0.01.

3 讨论

CircRNA广泛存在于真核生物中，具有结构稳定性、组织特异性和进化保守性等特征，能在多层面调控机体的生理和病理过程［9,10］。CircRNA的闭合环状结构使其比线性RNA更稳定，不易被降解，因此肿瘤中某些异常表达的circRNA可作为肿瘤临床诊断和判断预后的分子标记物以及潜在的治疗靶点［11-13］。文献报道：肝细胞癌患者血浆外泌体和组织中的circ-0051443显著降低，并且外泌体circ-0051443在肝癌诊断上具有较高的敏感性和特异性［14］。CircREEP3在结直肠癌中高表达，并与患者的不良预后相关［15］。本课题组前期研究也发现circSMARCA5可抑制胃癌进展并可作为良好的诊断和预后标记物［16］。

在本研究中，作者首先通过高通量测序构建了胃癌和癌旁组织中circRNA的差异表达谱，发现circPCSK5表达显著升高。进一步检索circBase数据库，我们发现circPCSK5由PCSK5基因的6、7、8和9号外显子反向剪接形成。前蛋白转化酶枯草溶菌素5（PCSK5）是一种前体蛋白加工酶，可使无活性的蛋白前体成熟并发挥生物学功能，在脂质、葡萄糖、胆汁酸代谢以及细胞增殖和转移等生物学行为中发挥关键作用［17,18］。在头颈部恶性肿瘤中，PCSK5可通过选择性剪接改变功能蛋白的结构域，从而调节免疫微环境和肿瘤进展［19］。PCSK5缺陷可使未成熟的前体GDF11在细胞内积累或以非活性形式释放，促进了三阴乳腺癌侵袭和转移［20］。CircPCSK5是我们课题组新发现的环状RNA，目前尚无相关文献报道。CircPCSK5是否也具有生物学功能，其在胃癌中的表达、功能以及临床意义仍不清楚，这是本研究探索的主要问题。

为了进一步探讨circPCSK5在胃癌中的临床意义，我们通过RT-qPCR方法检测62例患者胃癌和癌旁组织中circPCSK5的表达差异，发现circPCSK5在胃癌组织中表达显著升高，且circPCSK5表达水平与患者的肿瘤大小、淋巴结转移等临床病理变量存在明显正相关性，提示circPCSK5可能参与胃癌的发生发展。既往有关非编码RNA在胃癌中的研究多集中在表达和功能情况，而较少关注于患者的预后评估［21］。本研究中，我们发现circPCSK5高表达的胃癌患者呈现出更短的总生存和无病生存时间，并且是患者预后不良的独立危险因素。因此，本文结果提示circPCSK5是胃癌良好的转移预测和预后判断指标，可能具有较好的临床应用价值。

表5 胃癌患者无病生存期的单因素和多因素回归分析Tab.5 Univariate and multivariable analysis of disease-free survival in patients with gastric cancer

CircRNA参与调节肿瘤发生发展的多个环节，在肿瘤增殖和侵袭转移过程中也发挥重要作用［22］。研究发现：circPTEN1能够调控TGF-β/Smad信号通路抑制结直肠的侵袭转移［23］。CircHERC4可通过竞争性结合miR-556-5p，激活CTBP2/E-cadherin信号通路，进而促进结直肠癌细胞的增殖和侵袭［24］。CircACTN4在肝内胆管癌中表达上调，可以充当miR-424-5p的分子海绵，通过与YBX1互作转录激活FZD7，从而促进肝内胆管癌的增殖和转移［25］。为了进一步探索circPCSK5对胃癌细胞增殖和侵袭能力的影响，我们发现在HGC27细胞中敲低circPCSK5表达后细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著被抑制，而过表达circPCSK5 可明显促进MKN45细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

EMT在肿瘤的侵袭转移、干性维持和耐药等过程中均发挥重要作用［26］。EMT进程中细胞形态由上皮细胞向间质细胞转变，从而失去极性，细胞间的粘附减弱，是肿瘤细胞发生侵袭转移的关键因素［27］。CircRNA在肿瘤EMT 进程中也发挥重要调控作用［28］。circ_0000658下调可通过miR-498/HMGA2轴调控肿瘤细胞EMT，抑制膀胱癌进展［29］。本研究中，我们发现circPCSK5可使胃癌细胞发生EMT表型转化，从而促进肿瘤增殖和侵袭。文献报道circRNA 可通过充当miRNA海绵、结合蛋白、调控转录、编码短肽等多种机制发挥生物学功能［30］。CircPCSK5主要定位于细胞质，我们在后续研究计划中拟着重探讨circPCSK5通过充当miRNA海绵或与RNA结合蛋白互作的可能性，以进一步研究circPCSK5促进胃癌增殖和侵袭的具体分子机制。利用生物信息学分析、AGO2-RIP、RNA pulldown、双荧光素酶报告基因实验等，确定与circPCSK5结合的miRNA，并通过突变circPCSK5与靶miRNA的结合位点完成回复实验，明确circPCSK5是否通过吸附miRNA 在胃癌进展中发挥作用。此外，我们将通过RNA pull-down实验联合质谱分析鉴定circPCSK5的结合蛋白，检测circPCSK5通过影响互作蛋白在胃癌增殖和侵袭中发挥调控作用的可能性。

综上所述，circPCSK5在胃癌中表达升高，其高表达水平是患者预后不良的独立危险因素，并且circPCSK5 能够促进胃癌细胞的增殖、侵袭和EMT。CircPCSK5可能在胃癌进展中发挥重要调控作用，有望成为患者良好的预后预测指标和潜在的治疗靶点。