Numb通过上调V1G1的表达激活近端肾小管细胞mTORC1信号通路

刘 泽，尤 达，李 勇，何咏梅，李阿芳，李 潘，李春艳

湘南学院1护理学院，2临床学院，湖南 郴州 423000；3湖南中医药大学护理学院，湖南 长沙410000

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一种高度保守的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，属于磷酸肌醇3-激酶相关激酶家族［1-3］。mTOR在细胞内与其他蛋白相互作用形成两种结构和功能不同的复合物：mTOR复合物1（mTORC1）和mTOR复合物2［4-6］。mTORC1通过整合营养因素、生长因子等信号，直接磷酸化其下游关键效应因子蛋白核糖体S6激酶1（S6K1）和4E结合蛋白1（4EBP1）促进蛋白质合成、细胞生长和增殖［7,8］。在正常肾脏中，mTORC1在近端肾小管上皮细胞及其他肾实质细胞均有表达，对于维持细胞稳态具有重要作用［9-11］。近端肾小管上皮细胞mTORC1信号通路活性异常参与多种肾脏疾病的发生发展［11-14］。因此深入阐明近端肾小管上皮细胞中mTORC1信号通路的调控机制，有望为以mTORC1信号通路作为靶点治疗的肾脏疾病提供新思路和新靶点。

mTORC1受多种信号调节，如生长因子、氨基酸和细胞能量。AMP活化蛋白激酶（AMPK）作为一种关键的生理能量传感器，可通过磷酸化TSC2 或直接通过磷酸化Raptor 抑制mTORC1的活化［15,16］。溶酶体作为氨基酸介导mTORC1活化的主要场所，其功能的维持对于mTORC1信号通路的活化具有重要作用［17,18］。空泡型H+-ATP酶（V-ATPase）负责细胞内溶酶体等细胞器的酸化，对于维持溶酶体功能及mTORC1的活化具有重要作用［19,20］。下调V-ATPase亚基V1G1的表达可抑制V-ATPase活性及mTORC1的活化［21］。Numb基因具有控制细胞不对称分裂和细胞命运选择的功能［22］。哺乳动物Numb有3个主要的功能结构域，通过与不同的蛋白分子相互作用，参与p53、Notch等多条信号通路的调控［23-26］。研究证明，沉默MCF-7细胞中Numb基因的表达抑制溶酶体功能［27］。但是，Numb在近端小管上皮细胞mTORC1信号通路活化中的作用及作用机制尚不清楚。

本研究采用近端肾小管上皮细胞株NRK-52E细胞、正常小鼠肾脏组织及发生AKI的小鼠肾脏组织为研究对象，证明了Numb具有促进mTORC1活化的作用，并阐明其机制可能与上调V1G1的蛋白表达有关。本研究为阐明近端肾小管上皮细胞mTORC1信号通路的调控机制提供新的线索，为mTORC1活性异常介导的肾脏疾病的治疗提供新靶点。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

实验用野生型雄性BALB/c小鼠（南方医科大学动物中心），共25只，7周龄，体质量20～25 g。实验细胞株：正常大鼠近端肾小管上皮（NRK-52E）细胞由南方医科大学南方医院慢性肾病国家临床医学研究中心提供，人肾上皮细胞（293T）由郴州市第一人民医院转化医学研究所提供，小鼠用NC-siRNA（阴性对照siRNA）、Numb-siRNA（广州锐博），细胞用NC-siRNA、NumbsiRNA（上海吉玛），100X 氨基酸混合液、Lipofectamine2000（Invitrogen）、顺铂、IV 型胶原酶（sigma），高糖型DMEM培养基、DMEM-F12培养、胎牛血清、胰蛋白酶、EBSS培养基（Gibco），ECL化学发光试剂盒（碧云天），Percoll 分离液（Amersham Biosciences），原代肾小管上皮细胞培养基(Lifeline Cell Technology)，Numb、S6、p-S6、AMPK、p-AMPK、S6K1、p-S6K1、4EBP1、p-4EBP1、Megalin抗体（Cell Signaling Technology）、V1G1 及GAPDH 抗体（Proteintech），硝酸纤维素膜（Biorad），免疫组化试剂盒、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔、兔抗鼠二抗（北京中杉金桥），pSIN-EF2-puromycin空载病毒质粒、pSPAX2质粒及pMD2.G质粒由郴州市第一人民医院转化医学研究所提供，pSIN-EF2-V1G1-puromycin慢病毒质粒（南京金斯瑞），大肠杆菌DH5α感受态（康体生命）、质粒抽提试剂盒（天根），SureENTRY（Qiagen），阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）（Polyscience）。所有动物处理方案均经湘南学院动物实验伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠小干扰RNA（SiRNA）转染 所有动物都在湘南学院动物实验室22～24 ℃、50%～60%的湿度、12 h明暗循环环境下饲养。适应1周后将小鼠随机分为NC-siRNA处理组和Numb-siRNA处理组，5只/组。NC-siRNA处理组小鼠给予尾静脉注射NC-siRNA，Numb-siRNA处理组小鼠给予尾静脉注射Numb-siRNA。具体方法为将Numb-siRNA或NC-siRNA（5 nmol/L溶于0.2 mLDEPC水中）于10 s 内经小鼠尾静脉注射至体内，连续注射4 d，1 次/d，第5 天收集小鼠肾脏组织用于检测分析。Numb-siRNA 序列为5'-CAGCCUGUUUAGAGCGU AAdtdt-3'。

1.2.2 细胞siRNA转染 NRK-52E细胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基（完全培养基）在37 ℃、5%CO2的加湿培养箱中常规培养。培养融合度达80%～90%时，用0.25%的胰蛋白酶消化，传代接种到6孔培养板，待细胞生长融合至60%～70%时，按照Lipofectamine2000转染试剂盒说明书进行NC-SiRNA及Numb-siRNA的转染，转染48 h 后收集细胞通过Western blot 检测Numb的敲除效率。NC-siRNA序列为：GCGACGAU CUGCCUAAGAUdT，Numb-siRNA 序列为：GCACC UGCCCAGUGGAUCCTT。

1.2.3 氨基酸诱导mTORC1活化的细胞模型 NRK-52E细胞用完全培养基在37 ℃、5%CO2的加湿培养箱中常规培养。待培养融合度达80%～90%或者转染siRNA 48 h后，弃除完全培养基，给予1 mL EBSS培养基孵育50 min，使细胞处于氨基酸饥饿状态，然后加入10 μL/孔100×氨基酸混合液至1×工作浓度刺激10 min。

1.2.4 顺铂诱导的AKI小鼠模型 雄性BALB/c小鼠随机分为生理盐水对照组、顺铂处理组及Numb干预组。对照组给予NC-siRNA及生理盐水注射；顺铂处理组给予NC-siRNA 及顺铂注射；Numb 干预组给予NumbsiRNA及顺铂注射。顺铂处理组和对照组模型建立方法为腹腔单次注射顺铂/生理盐水25 mg/（kg·d）。具体建模方法为：NC-siRNA或Numb-siRNA注射完成后，第2天进行顺铂/生理盐水注射构建AKI小鼠模型，在建模期间隔天注射1次NC-siRNA或Numb-siRNA，第3天收集小鼠肾脏组织及血液标本。

1.2.5 免疫组化染色检测Numb、Megalin的表达与分布采用SP二步法，将4 μm厚的组织切片行脱蜡、水化、微波炉加热进行抗原修复；30 mL/L H2O2去离子水孵育，一抗Numb（1∶100）、Megalin（1∶100），4 ℃孵育过夜；PBS洗涤后，加相应二抗孵育，DAB显色，自来水充分冲洗、复染、脱水、封片，光镜下观察并拍照。

1.2.6 原代近端肾小管上皮细胞分离及培养 雄性BALB/c小鼠按照上述方法注射NC-siRNA或NumbsiRNA后，第2天小鼠经5%水合氯醛麻醉后，75%乙醇中浸泡5 min，勿将小鼠口鼻浸入乙醇中。超净台中剖开小鼠胸腹部，取双肾置于冷PBS中去除肾蒂及包膜，取薄层肾皮质于PBS中剪碎至1 mm3，PBS洗涤800 r/min离心2次，5 min/次。弃上清液，加入0.75 mg/mL的IV型胶原酶消化液(含5%胎牛血清），终质量浓度为1 g/L，37 ℃振荡消化15 min，用1 mL 移液枪充分抽吸组织消化液使组织充分裂解，然后用等体积含10%胎牛血清的PBS 中止消化，将组织消化液置于4 ℃以50×g离心2 min收集肾小管。DMEM-F12培养基洗涤后，用32%Percoll 分离液重悬沉淀，以2000×g、4 ℃离心10 min。离心后可见液体分层，吸取近管底第2层细胞悬液，即为近端肾小管节段及其游离的肾小管上皮细胞。15 mL DMEM-F12培养基洗涤，并以1000 r/min离心10 min以去除残留的Percoll分离液。纯化的近端小管使用原代近端肾小管上皮细胞培养基重悬后接种到60 mm的培养皿中，于37 ℃、5%CO2细胞孵箱静置培养，隔天换液。原代培养待5～6 d 细胞长满后，用0.05%胰蛋白酶消化并传代培养。

1.2.7 慢病毒载体的包装 委托南京金斯瑞生物科技有限公司构建V1G1过表达的慢病毒重组质粒pSIN-EF2-V1G1-puromycin，将制备好的pSIN-EF2-V1G1-puromycin 质粒、对照空载病毒质粒pSIN-EF2-puromycin 及其2 种辅助病毒包装原件载体质粒pSPAX2、pMD2.G分别进行高纯度无内毒素抽提。将上述得到质粒，pSIN-EF2-V1G1-puromycin/pSIN-EF2-V1G1-puromycin、pSPAX2、pMD2.G与PEI转染试剂混匀并在室温中孵育20 min，将上述混合液分别缓慢加入到293 T 细胞中混匀后继续培养24 h，然后将基础培养基更换为2%血清的培养基，继续培养48 h后收集转染后的293T细胞上清液，再于7000 r/min离心5 min，收集的上清即为V1G1过表达慢病毒颗粒及空载慢病毒颗粒，将其按照500 μL/管进行分装，冻存于-80 ℃备用。

1.2.8 慢病毒感染 NRK-52E细胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基在37 ℃、5%CO2的加湿培养箱中常规培养，将其接种于6 孔培养板，待其细胞融合度60%～70%时，按照SureENTRY转染试剂盒说明书进行V1G1过表达慢病毒及空载慢病毒的感染，感染48 h后收集细胞通过Western blot检测V1G1的过表达情况。

1.2.9 siRNA转染、慢病毒感染和氨基酸饥饿/再刺激共处理 将NRK-52E细胞随机分为对照组、Numb沉默组以及V1G1干预组。对照组细胞进行NC-siRNA转染及空载慢病毒感染；Numb 沉默组进行NumbsiRNA 感染及空载慢病毒感染；V1G1 干预组进行Numb-siRNA感染及V1G1过表达慢病毒感染。待细胞融合度为60%～70%进行siRNA转染，12 h后进行慢病毒感染，培养48 h后再构建氨基酸诱导mTORC1活化的细胞模型。

1.2.10 Western blot法检测相关蛋白的表达 收集的肾脏及细胞使用RIPA蛋白裂解液提取总蛋白，采用蛋白质二甲喹啉甲酸法（BCA法）进行蛋白定量分析；加入2X SDS上样缓冲液至终浓度为1X，蛋白于100 ℃煮10 min；用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白后将蛋白由凝胶转至硝酸纤维素膜上；使用5%脱脂奶粉于室温封闭1 h后，剪出所需蛋白条带用相应的一抗于4 ℃孵育过夜；次日采用相应的HRP标记二抗于室温孵育1 h，加入化学发光试剂，使用化学发光仪进行拍照，Fluorchem 8900 软件分析蛋白条带的灰度值。

1.3 统计学分析

采用统计学软件SPSS 20.0 软件进行数据分析。定量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验；3组比较采用单因素方差分析；4组比较采用两因素方差分析，组间两两比较则采用SNK-q检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Numb对小鼠近端肾小管上皮细胞中mTORC1信号通路活性的影响

Western blot结果显示：与NC-siRNA 处理组相比，Numb-siRNA 处理组小鼠肾脏Numb、p-S6的蛋白表达水平下调（P＜0.05，图1A、B、D、E）。免疫组织化学染色结果显示：Numb基因主要在肾脏近端肾小管上皮细胞表达，与NC-siRNA 处理组相比，Numb-siRNA 处理组小鼠肾脏近端肾小管上皮细胞Numb蛋白表达水平降低，但不影响近端肾小管标记蛋白Megalin的表达与分布（图1C）。

图1 Numb对小鼠近端肾小管上皮细胞中mTORC1信号通路活性的影响Fig.1 Effect of Numb knockdown on activity of mTORC1 pathway in mouse proximal tubules.A,B: Western blotting for detecting Numb protein expression in the kidneys of Numb-siRNA-treated mice and NC-siRNAtreated mice(n=5,*P＜0.05).C:Immunohistochemistry for detecting Numb(upper panel)and megalin(lower panel)expressions in sequential sections of the kidney tissues from Numb-siRNA treated mice and NC-siRNA treated mice (Scale bar: 50 μm).Upper arrows indicate an decreased expression of Numb,and lower arrows indicate an unchanged expression of Megalin.D,E: Western blotting for detecting the protein level of p-S6 in the kidneys of Numb-siRNA-treated mice and NC-siRNA-treated mice.S6 was used to verify equivalent loading(n=5,*P＜0.05).

2.2 Numb对AKI诱导的肾脏mTORC1信号通路活化的影响

Western blot 结果显示：与对照组小鼠相比，NCsiRNA+顺铂处理组小鼠肾脏p-S6K1 和p-4EBP1的蛋白表达水平上调（P＜0.05），而与NC-siRNA+顺铂处理组小鼠相比，Numb-siRNA+顺铂处理组小鼠肾脏p-S6K1 和p-4EBP1的蛋白表达水平下调（P＜0.05，图2A～C）。

图2 Numb对AKI诱导的肾脏mTORC1信号通路活化的影响Fig.2 Effect of Numb knockdown on ctivity of mTORC1 pathway in proximal tubules in cisplatin-induced AKI mouse model.A:Western blots of p-S6K1,S6K1,p-4EBP1,and 4-EBP1 in the kidneys of the mice in different groups.S6K1 and 4-EBP1 were used to verify equivalent loading for p-S6K1 and p-4EBP1,respectively.B: Quantitative analysis of p-S6K1 to total S6K1 ratio.C:Quantitative determination of p-4EBP1 to total 4-EBP1 ratio.*P＜0.05 vs NC-siRNA-treated mice with saline treatment;#P＜0.05 vs NC-siRNA-treated mice with cisplatin treatment(n=5).

2.3 Numb对NRK-52E细胞中mTORC1 信号通路活性的影响

Western blot显示：细胞给予PBS培养50 min后，p-S6的蛋白表达水平降低，而再给予1×氨基酸刺激10 min后，p-S6的蛋白表达水平上调（P＜0.05，图3A、B）；在NC-siRNA 转染的细胞中，氨基酸再刺激促进S6的磷酸化，而转染Numb-siRNA的细胞中，Numb及p-S6的蛋白表达水平较对照组均显著下调（P＜0.05，图3C～E）。

图3 Numb对NRK-52E细胞中mTORC1 信号通路活性的影响Fig.3 Effect of Numb knockdown on the activity of mTORC1 pathway in NRK-52E cells.A:Western blotting for detecting phosphorylation of S6 in NRK-52E cells after amino acid starvation and readdition.B:Quantitative determination of p-S6 in the cells(*P＜0.05 vs-/-controls;#P＜0.05 vs starved cells.n=3).C:Amino acids readdition failed to restore the phosphorylation of S6 in cells with Numb-siRNA transfection compared with cells with NC-siRNA transfection.D:Quantitative determination of Numb and S6 in each group(**P＜0.01 vs NC-siRNA-transfected cells with starvation;#P＜0.05 vs NC-siRNA-transfected cells with amino acid mixture readdition).E:Quantitative determination of p-S6 in each group(**P＜0.01 vs NC-siRNA-transfected cells with starvation.#P＜0.05 vs NC-siRNAtransfected cells with amino acid mixture readdition.n=3).

2.4 Numb对近端肾小管上皮细胞中AMPK活性的影响

Western blot 结果显示：在NRK-52E 细胞中，与NC-siRNA处理组相比，Numb-siRNA处理组细胞中p-AMPK 的蛋白表达水平下调（P＜0.05，图4A）；与NCsiRNA 处理组小鼠相比，Numb-siRNA 处理组小鼠肾脏p-AMPK的蛋白表达水平下调（P＜0.05，图4B）；为了进一步证实Numb促进近端肾小管上皮细胞中AMPK的活化，我们从Numb-siRNA处理组小鼠和NC-siRNA处理组小鼠中提取了原代近端肾小管细胞。Western blot结果显示：与NC-siRNA处理的小鼠原代近端肾小管细胞相比，Numb-siRNA处理的小鼠原代近端肾小管细胞中的Numb和p-AMPK表达水平均下调（P＜0.05，图4C、D）。

图4 Numb对近端肾小管上皮细胞中AMPK活性的影响Fig.4 Effect of Numb knockdown on the activity of AMPK in proximal tubular cells.A:Western blotting for detecting p-AMPK and AMPK in Numb-siRNA-or NC-siRNA-transfected NRK-52E cells and quantitative determination of p-AMPK to total AMPK ratio (n=3.*P＜0.05).B:Western blotting for detecting p-AMPK and AMPK in the kidneys of Numb-siRNA-treated mice and NC-siRNA-treated mice and quantitative determination of the p-AMPK to total AMPK ratio(n=5.*P＜0.05).C:Western blotting for detecting Numb expression in the primary proximal tubular cells from Numb-siRNA-treated mice and NC-siRNA-treated mice and quantitative determination of Numb to GAPDH ratio.D:Western blotting for detecting p-AMPK and total AMPK expressions in the primary proximal tubular cells(n=5.*P＜0.05).

2.5 V1G1是Numb的功能靶点，V1G1可逆转Numb沉默导致的mTORC1活化的抑制

Western blot 显示：在NRK-52E 细胞中，与NCsiRNA 处理组相比，Numb-siRNA 处理组细胞中V1G1 的蛋白表达水平下调（P＜0.05，图5A、B）；感染V1G1过表达慢病毒的NRK-52E细胞V1G1蛋白表达上调（图5C）；与NC-siRNA 处理组相比，转染NumbsiRNA后抑制氨基酸介导的S6的磷酸化（P＜0.01），而感染V1G1过表达慢病毒可逆转Numb沉默介导的p-S6的蛋白表达水平的降低（P＜0.05，图5D～F）。

图5 Numb通过上调V1G1促进氨基酸介导的NRK-52E细胞中mTORC1的活化Fig.5 Numb promotes amino acid-induced activation of mTORC1 by upregulating V1G1 protein expression in NRK-52E cells.A,B:Western blotting for detecting the protein levels of V1G1 in Numb siRNA or NC-siRNA-transfected NRK-52E cells(n=3.*P＜0.05).C: Western blotting for detecting protein levels of V1G1 in NRK-52E cells with V1G1 overexpression.D: V1G1 overexpression restores the phosphorylation of S6 in cells with Numb-siRNA transfection.E: Quantitative determination of V1G1 and S6 in each group(**P＜0.01 vs NC-siRNA-transfected cells with amino acid mixture readdition;#P＜0.05 vs NumbsiRNA transfected cells with amino acid mixture readdition).F:Quantitative determination of p-S6 in each group(**P＜0.01 vs NC-siRNA transfected cells with amino acid mixture readdition;#P＜0.05 vs Numb-siRNA transfected cells with amino acid mixture readdition).

3 讨论

mTORC1是一个从酵母到哺乳动物都保守存在的复合体，通过促进蛋白质的翻译以及合成等方式，促进细胞的生长和增殖［2,28］。在肾脏近端肾小管上皮细胞中mTORC1具有丰富表达，其活性异常是AKI等肾脏疾病发生发展的重要原因［11-14］。因此，阐明近端肾小管上皮细胞中mTORC1 信号通路的调控机制，将为mTORC1活性异常相关性肾脏疾病的治疗提供新靶点。Numb是一种多功能蛋白，参与调控多种信号通路的传导［24-26］。我们前期研究证明，Numb在肾脏主要表达于近端肾小管上皮细胞，在AKI、CKD的发生发展中均发挥着重要作用［29-31］。关于Numb在近端肾小管上皮细胞mTORC1信号通路中的调控作用和机制的研究尚未见报道，因此，本研究旨在探讨Numb对近端肾小管上皮细胞中mTORC1信号通路活化的影响及其潜在的分子机制。

mTORC1是一种营养传感器，当细胞接受到氨基酸、生长因子等信号刺激后，mTORC1从细胞胞浆转移至溶酶体而被激活［32］。研究发现，溶酶体功能受损抑制氨基酸诱导mTORC1信号通路的活化［17,18］。最近的一项研究表明，在MCF-7细胞中，沉默Numb基因的表达抑制Rab7活性和溶酶体功能［27］。提示Numb可能参与近端肾小管上皮细胞中mTORC1信号通路活性的调控。近有研究报道，同时敲除成骨细胞中Numb 和Numbl基因通过抑制PTEN蛋白的降解抑制mTORC1信号通路的活化［33］。本研究表明，在Numb表达水平下调的NRK-52E 细胞株、正常小鼠肾脏及顺铂诱导的AKI 小鼠模型肾脏中，mTORC1 下游信号分子S6、S6K1和4EBP-1的磷酸化水平显著降低，说明在生理情况及AKI病理情况下，Numb均具有促进近端肾小管细胞中mTORC1 信号通路活化的作用，与既往研究一致。接下来，我们进一步探讨Numb激活mTORC1信号通路的潜在分子机制。

AMPK 作为机体代谢的重要调控分子，是mTORC1的负性上游调控分子，直接参与对mTORC1活性的调节［34］。研究证明，AMPK 可以通过磷酸化TSC2 或直接通过磷酸化Raptor 抑制mTORC1信号通路的活化［15,16］。本研究结果显示，在Numb表达水平下调的NRK-52E细胞、小鼠肾脏或者原代近端肾小管上皮细胞中，p-AMPK的蛋白表达水平均是下调的，说明下调近端肾小管上皮细胞中Numb的表达抑制AMPK的活化，与我们预想结果相反。另有研究报道，溶酶体V-ATPase-ragulator 复合物是AMPK和mTORC1活化的共同激活剂，V-ATPase 酶活性降低，导致AXIN/LKB1-AMPK 复合物和mTORC1从溶酶体外膜解离，从而分别抑 制LKB1 和Rheb-GTP 对AMPK 和mTORC1 的激活［35］。因此，我们认为Numb可能通过稳定V-ATPase的酶活性从而激活mTORC1信号通路。

V-ATPase是一类特殊的膜转运蛋白，是由14个亚基组成的质子泵，只有V0 和V1亚单位相结合才能发挥其蛋白酶的作用［36］。V-ATPase 位于溶酶体等多种细胞器的膜上，通过与Ragulator形成复合物，促进mTORC1的溶酶体定位及其活化［33］。研究发现，下调宫颈癌（Hela）细胞中V-ATPase亚型V1G1 的蛋白表达抑制VATPase 活化以及溶酶体功能［37］。有研究证明，小分子天然产物Verucopeptin 靶向V-ATPase的V1G亚基，有效的抑制V-ATPase的活性和mTORC1信号通路的活化［21］。本研究结果显示，沉默NRK-52E细胞中Numb的表达，V1G1蛋白表达水平显著下调，V1G1过表达可以逆转Numb沉默所介导的mTORC1活化的抑制作用，该结果表明Numb可以通过上调NRK-52E细胞中V1G1的蛋白表达激活mTORC1信号通路，与既往研究一致［21］。

综上所述，本研究表明，Numb可通过上调V1G1的蛋白表达，促进近端肾小管上皮细胞中mTORC1信号通路的活化。这揭示了mTORC1信号通路的新分子调控机制，为由mTORC1活性异常介导的肾脏疾病的治疗提供了新的治疗靶点。