环青海湖地区两种引种禾本科牧草根际真菌群落对有机肥的响应

马 坤, 赵阳安, 周学丽,2, 王英成, 金 鑫, 张海娟, 颜珲璘, 张卓航, 邱鹏滢, 芦光新*

(1.青海大学农牧学院， 青海 西宁 810016； 2.青海省草原改良试验站， 青海 共和 813000)

作为陆地生态系统最重要的组成部分之一，青藏高原具有复杂多样的微生物群[1]，使得生长在青藏高原地区的植物也具有独特的生活习性[2]。‘川草2号’老芒麦(Elymussibiricus‘Chuancao No.2’)和‘阿坝’垂穗披碱草(Elymusnutans‘Aba’)极具抗寒抗旱能力，两种优质牧草在高寒地区的引种对生产发展和生态保护极具意义。由于草地资源的过分利用，导致青藏高原地区土壤养分消耗也逐渐增加。施肥是缓解土壤养分匮乏的重要手段之一[3]，近年来，化肥的大规模施用给青藏高原地区带来了一系列环境和生态问题，使草地生产力下降，逐渐不能满足畜牧业的需求，限制了畜牧业发展[4]。鉴于青海省草地生态保护价值和意义，以及政府对于化肥农药减量使用政策的实施，有机肥替代化肥已成为青海地区的必然趋势。

根际微生物作为土壤微生物重要的组成部分之一[5]，在陆地生态系统中扮演着重要功能[6]，是陆地生态系统土壤质量、生产力和可持续性的敏感指标，对植物养分吸收、抵御逆境等方面具有重要作用[7]，同时，根际微生物可以促进植物生长，根际微生物通过取食(侵染)根、或形成共生关系(如菌根)、或产生植物激素/减少胁迫信号促进植物生长，与植物直接互作[8]。作为异养菌，真菌是生态系统中有机物分解和养分转化的关键参与者，施肥是维持土壤肥力的常用方法之一，已被证明对土壤真菌群落有很大影响[9]。Yang等[10]基于青藏高原东部和中部的样带研究发现高寒草地土壤真菌多样性主要受地上植物多样性和土壤属性决定，相较于其他土壤微生物类群，真菌对贫瘠干旱的土壤环境有着更强的适应性。研究证明，与化肥相比，有机肥对土壤真菌群落的影响更为显著，导致真菌多样性和分类组成发生更大的变化[11-12]。研究指出，施用有机肥提供的营养基质缓解了菌群间的竞争，土壤微生物的种类和数量不仅对土壤有机质和土壤养分的转化和循环具有动态性，而且是土壤中植物有效养分的储备库，与土壤肥力密切相关[13]。施用有机肥对土壤真菌群落组成的影响主要是通过改变土壤特性，尤其是土壤碳库来实现的[14]。有机肥中营养物质对真菌类群有较大的选择性，从而增强了生态位过滤对真菌群落的作用，进而降低真菌丰富度[15]。

以环青海湖地区引进种植的两种禾本科(‘川草2号’老芒麦、‘阿坝’垂穗披碱草)为研究对象，通过田间试验，采用ITS rDNA Illumina高通量测序技术，分析研究了施用有机肥后对两种禾本科牧草农艺性状、根际土壤环境和真菌群落的影响，为有机肥在高寒地区的推广提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

禾本科牧草：由四川省川草生态科技有限责任公司提供的‘阿坝’垂穗披碱草(Elymusnutans‘Aba’)和‘川草2号’老芒麦(Elymussibiricus‘Chuancao No.2’)；有机肥(有机质含量≥45%，N+P2O5+K2O≥5%，pH值 5.5～8.5)：由四川农业大学资源学院提供技术配方，主要以富含有机质的农作物秸秆和家禽粪便为原料，添加生物发酵剂加工而成。

1.2 试验地点

试验地点位于青海省铁卜加草原改良试验站，地处青海湖西岸，东经99°35′，北纬37°05′，海拔3 270 m。该地区属高山高原气候，具有光照充足、日照强烈、冬寒夏凉、降雨集中、干旱少雨、风大等气候特征，在青藏高原具有高寒草地生态环境的典型性、代表性。年平均气温-0.7℃，最热月(7月)平均气温17.5℃，最冷月(1月)平均气温-22.6℃，极端温度-34.3℃。无霜期平均为78.7 d，无绝对无霜期。日照时数2 670 h，≥0℃年积温1 331.3℃，年降水量368.11 mm，年蒸发量1 495.3 mm，相对湿度58%。

1.3 试验设计

试验于2020年5月进行，在青海省草原改良试验站选择400 m2的地块作为种植引种两种牧草的试验区。试验分为施肥处理和未施肥处理，各重复6次，共12个小区，每个小区面积为15 m2(3 m×5 m)，每两个小区之间的间距为1 m，播种时以20 cm 的间隔条播于5 cm深的沟内，每个小区共播种12行。不施有机肥的小区被标记为CK，施肥处理的小区施有机肥量为7.88 kg。

图1 试验地小区分布图Fig.1 Distribution of test site plots

1.4 样品采集及测定方法

1.4.1样品采集 采样时间为2020年9月12日至13日，每个小区随机抽取10株，共120株进行标记，卷尺测定根茎基部至离生长点最近的展开叶顶端的绝对高度为株高。在每个长势均匀的小区中，选择一个50 cm×50 cm的样方进行采样，共12个样方。选好样方后，先将地面部分剪掉，然后用小土铲在垂直的土壤中，挖出30 cm深度的根系，采取“抖根法”抖落植株根系周围的土壤作为根周土，用刷子刷下根系上粘附的土作为根际土，均质化并过筛(<2 mm)以去除根部和其他植物材料，然后放在冰上运输，土壤样品分为两部分，一部分用于确定理化性质，另一部分储存在—80℃用于分子实验(DNA提取)。将处理好的根系放入装有一定量水的量筒中，使水完全淹没样品，然后用玻璃棒轻轻搅拌，防止空气存在，静置几分钟后，测量溶液的体积，计算出根系的体积，然后放置样品。带回实验室，放入105℃烘箱中24小时，冷却后称重(地上生物量干重与此方法一致)。

1.4.2土壤理化性质测定 用于土壤理化性质测定的样品风干、粉碎后，过0.25 mm孔径网筛进行土壤养分测定。土壤pH值使用pH计(pHS-3C)测定，土壤有机碳(Soil organic carbon,SOC)用重铬酸钾硫酸外加热法；土壤全氮(Total nitrogen,TN)用半微量凯氏定氮法。

1.4.3土壤微生物测序及分析 从—80℃的冰箱中取出装有样品的无菌管，在超净工作台中取无菌管中的土壤10 g，去除植物残留物和石砾后装于5 ml的无菌管中，放于附有冰袋的泡沫箱中寄到中国科学院生态环境研究中心，采用ITS扩增子测序分析技术测定土壤微生物的多样性及群落结构。采用土壤DNA提取试剂盒(MOBIO Laboratories，Carlsbad，CA,美国)操作方法对所有12个土壤样本进行DNA的提取。所有样品浓度和纯度使用Nanodrop2000进行检测，浓度均在20 ng·μL—1以上，A260/A280是1.8～2.0，说明土壤样本DNA浓度及纯度较好，可进行PCR实验。对24个土壤样本进行ITS rDNA的基因扩增，将所有原始数据以FASTQ格式以及样本对应的Barcode信息上传到中科院环境所邓晔课题组Galaxy分析平台上(http://mem.rcees.ac.cn:8080)进行分析[16]。使用Trim Primer将正反向引物去除。通过FLASH将正反向序列进行拼接，通过Trim by sequence length对序列进行筛选和修剪，保留长度在245～260 bp的目的序列。目的序列通过Unoise方法按97%相似度进行OTU归类，生成原始OTU表，并对原始表进行重抽，使每个样品序列数相同，重抽后的OTU进行后期统计分析[17-18]。

1.5 数据处理

本研究使用Microsoft Excel 2016 和SPSS 23.0对数据进行了统计分析。使用单向方差分析(单向分析)和多重比较分析(LSD)，并进行最小显着差异(LSD)检验以比较5%概率水平的平均值。进行了皮尔逊相关分析和主成分分析。高通量测序后的原始数据进行质量控制以获得基因注释的OTU表。图中数据均以平均值±标准差表示。并且在完成上述研究内容的基础上，绘制和弦图(chord Diagram)，是一种显示矩阵中数据间相互关系的可视化方法，节点数据沿圆周径向排列，节点之间使用带权重(有宽度)的弧线链接，节点权重决定节点大小，又决定节点位置，同时和弦图的连线使用源权重和目标权重控制线宽，粗细非均匀，而且和弦图的节点宽度为连线宽度之和，节点处的连线平铺不重叠。采用冗余分析(RDA)、相关性分析和构建分子生态网络(相关网络根据随机矩阵理论(RMT)从OTUs构建)的方法，研究草地微生物群落组成结构变化及其与环境相互影响。所有测序的原始数据均于中科院生态环境研究中心邓晔研究员课题组的Galaxy分析平台(http://mem.rcees.ac.cn:8080)完成。

2 结果与分析

2.1 两种禾本科牧草生物量与茎叶比

如图2所示，有机肥的添加显著影响两种禾本科牧草的生物量(P<0.05)。‘川草2号’老芒麦中，有机肥处理下的地上鲜重、地下鲜重和地下干重均显著高于CK，施有机肥后地上鲜重、地下鲜重和干重分别为2 235.13，38.46，21.27 g。阿坝垂穗披碱草中，有机肥处理下地上鲜重、地下鲜重、地下干重较CK分别增加了205.30，24.67，15.96 g。茎叶比是饲料品质评定的重要指标之一，叶的比重愈高，牧草品质越好,有机肥降低了两种牧草的茎叶比，其中，披碱草茎叶比受有机肥的影响比老芒麦更强(图2B)。

图2 A两种牧草地下生物量，B两种牧草地上鲜重及茎叶比Fig.2 A. Underground biomass of two pastures. B. Aboveground fresh weight and stem-to-leaf ratio of the two pastures注：CK表示不施肥处理，F表示有机肥处理。不同小写字母表示老芒麦在不同处理下的显著差异，不同大写字母表示披碱草在不同处理下的显著差异。下同Note:CK means no fertilization treatment,F means organic fertilizer treatment. Different lowercase letters indicate significant differences in different treatments of Elymus sibiricus ‘Chuancao No.2’,and different uppercase letters indicate significant differences in different treatments of Elymus nutans ‘Aba’.The same as below

2.2 土壤理化性质

通过对阿坝垂穗披碱草和‘川草2号’老芒麦增施有机肥的试验，结果表明：在披碱草中，与对照相比，有机肥显著增加土壤总氮含量，明显降低土壤pH(P<0.05)；土壤有机质含量显著增加0.77%(P<0.05)，表明增施有机肥后有效缓解土壤碱化，氨氮、硝氮变化不明显。在老芒麦中，与CK相比，施用有机肥后土壤有机碳显著上升，其他指标变化均不显著。

表1 土壤的基本化学性质Table 1 Basic chemical properties of soils

2.3 微生物群落结构

两种禾本科牧草根际微生物群落结构如和弦图(图3)所示，对土壤真菌属水平的分析表明土壤真菌不同属在不同处理下的分布存在较大的差异，不同处理下的优势属也各不相同。赤霉菌属(Gibberella)、亚隔孢壳属(Didymella)、裂壳菌属(Schizothecium)属为主要优势属，平均相对丰度在 8.0%～16.5%之间；Kotlabase、Preussia、Fusarium属为次要优势属。老芒麦样地中，增施有机肥后主要优势属与次要优势属相对丰度皆出现下降；披碱草样地中，增施有机肥后Didymella、Schizothecium、Kotlabase属的相对丰度下降，而赤霉菌属(Gibberella)、内生真菌(Preussia)、Fusarium属的相对丰度上升，其平均相对丰度分别为17.6%，7.5%，4.4%。

图3 微生物和弦图Fig.3 Microbial chord diagram注：(a)‘川草2号’老芒麦，(b)‘阿坝’垂穗披碱草。物种与样本关系的和弦图，圆圈上边为物种名，下边为样品名，各用不同颜色表示。物种丰度以百分比展示。连线表示某样本存在某物种，线段越粗，该物种含量越丰富Note:(a) Elymus sibiricus Linn,(b) Elymus nutans ‘Aba’. Chord diagrams of species-sample relationships,with species names at the top of the circles and sample names at the bottom,each indicated by a different color. Species abundance is shown as a percentage. Connecting lines indicate the presence of a species in a sample,and the thicker the line segment,the more abundant the species is

2.4 微生物与环境因子变量间的相关性分析

RDA分析结果显示(图4)，在老芒麦中微生物与环境变量在1，2轴的解释率分别为23.9%和16.31%，在披碱草中解释率分别为27.91%和13.88%。两种牧草中丰度排名前十的属与环境因子之间的Spearman分析表明，在老芒麦中，主要优势属赤霉菌(Gibberella)与pH、株高、有机碳呈显著正相关(P<0.05)，其中pH对赤霉菌影响强度最强烈，而与全氮、硝态氮及铵态氮呈显著负相关；裂殖壶菌(Schizothecium)与pH、铵态氮及株高呈正相关，与地下生物量和全氮呈负相关；作为子囊菌纲的亚隔孢壳属(Didymella)与地下生物量、SOC呈显著正相关，而与pH、铵态氮、硝态氮呈显著负相关。次要优势属内生真菌(Preussia)与硝态氮、铵态氮均呈现出显著的正相关。在披碱草中，Gibberella、Preussia、Fusicoua都与SOC、地下生物量、株高、TN呈显著正相关(P<0.01)，与硝态氮、铵态氮呈负相关；亚隔孢壳属(Didymella)、裂殖壶菌(Schizothecium)与pH、硝态氮呈正相关，与SOC、株高、地下生物量呈负相关。

图4 RDA分析图Fig.4 RDA analysis plot注：(a)‘川草2号’老芒麦，(b)‘阿坝’垂穗披碱草。黑色箭头表示环境因子；红色箭头表示不同的细菌类型；箭头长度表示环境变量和微生物之间的相关性强度。箭头长度越长，相关性越强。图中微生物与环境变量轴之间的垂直距离反映了它们之间的相关性。距离越小，相关性越强Note:(a) Elymus sibiricus ‘Chuancao No.2 Linn’,(b) Elymus nutans ‘Aba’. Black arrows indicate environmental factors;red arrows indicate different bacterial types;The arrow length represents the strength of the correlation between the environmental variables and the microbes. The longer the arrow length,the stronger the correlation. The perpendicular distance between microbes and environmental variable axes in the plot reflects their correlations. The smaller the distance,the stronger the correlation

2.5 组内网络共生关系

为了进一步明确有机肥的添加对牧草根际微生物的影响，本实验对真菌在属水平进行组内共生关系研究，网络拓扑参数见表2。在老芒麦中，与CK相比，有机肥降低了真菌群落的网络节点数(Total number of nodes)，增加了模块性，增加主要优势菌赤霉菌属与稀有菌群Tetracladium，Nectria，Zymoseptoria，Ilyonectria，Wardomyces，Phaeomycocentrospora，Trichothecium等物种间的相互作用关系(图5)，削弱了优势菌亚隔孢壳属与其它真菌的共生关系(图5)。在披碱草中，与CK相比，有机肥增加了网络节点数(Total number of nodes)、模块性及网络密度。披碱草根际微生物间的互作关系对有机肥较敏感，有机肥的添加增加了稀有菌群间的共生关系，增强了真菌群落间的联系性。

表2 不同处理微生物互作网络拓扑性质Table 2 Topological properties of microbial interaction networks for different treatments

图5 网络分析Fig.5 Network analysis注：A老芒麦在CK处理下根际真菌属水平下的共生关系，B老芒麦在有机肥处理下根际真菌属水平共生关系；C披碱草在CK处理下根际真菌属水平共生关系，D披碱草在有机肥处理下根际真菌属水平共生关系。节点根据模块化类别着色。连接表示强(r>0.8)和显著(P<0.01)相关，每个节点的大小与连接数成正比Note:A symbiosis of Elymus sibiricus Linn under CK treatment,B symbiosis of Elymus sibiricus Linn under organic fertilizer treatment,C symbiosis of Elymus nutans ‘Aba’ under CK treatment,D symbiosis of Elymus nutans ‘Aba’ under fertilizer treatment Nodes are colored according to the modularity category. Connectivity was strongly (r>0.8) and significantly (p < 0.01) correlated,and the size of each node was proportional to the number of connections

3 讨论

3.1 有机肥对两种禾本科牧草生长及土壤理化性质的影响

本研究发现施用有机肥可以提高环青海湖地区两种牧草的株高、地上和地下生物量，改变牧草茎叶比，调整营养分配。禾本科牧草对氮肥敏感，速效氮被植物快速吸收利用，植物高度和植物生物量会发生明显的变化[19]。Elymussibiricus‘Chuancao No2’和Elymusnutans‘Aba’是两种抗寒抗旱能力极强的牧草，施用有机肥可以很好地促进牧草的生长，提高营养质量[20-21]。土壤物理性质是表征土壤肥力大小的重要参数[22]，有机肥对土壤的影响不仅体现在物理性质更多还体现在化学性质方面。高宗等[23]发现单施有机肥可以显著增加土壤全氮含量，宋震震等[24]研究发现长期施用有机肥可显著提升土壤微生物氮、有机碳含量。土壤有机质也是表示土壤化学肥力高低的重要参数之一，有机肥可有效提升和更新土壤有机质，提升土壤酸碱缓冲能力，促进土壤微生物生长繁育[25]。本试验发现，短期施加有机肥能增加土壤全氮及有机碳含量，降低土壤pH,缓解土壤盐碱化程度。

3.2 两种牧草真菌群落与土壤化学性质的关系

为进一步明确有机肥对高寒地区土壤真菌群落的影响，本研究在属水平进行群落组成比较，两种牧草根际真菌在属水平均具有较高的平均相对丰度。真菌属的丰度分析表明，赤霉菌属(Gibberella)、亚隔孢壳属(Didymella)、裂殖壶菌属(Schizothecium)为主要优势菌，Kotlabase，preussia(内生真菌属)和Fusarium(镰刀菌属)为次要优势菌。两种牧草真菌群落对有机肥的响应各不相同，在老芒麦中，有机肥添加后降低了主要优势菌与次要优势菌的平均相对丰度，这一实验结果与研究者在农田中发现的结果相一致，他们田间试验结果表明，与化肥相比，有机肥的施用降低了真菌多样性，主要是通过促进真菌灭绝而非迁移[26]。有机肥对真菌群落的选择性高于化肥，有利于腐生生物的生长，从而导致土著物种的灭绝，减少物种间的联系[27]。真菌群落的变化与土壤性质特别是土壤碳资源的变化密切相关[28]。结果表明，种的筛选对真菌群落的组成具有重要意义，施肥主要通过形成生境的生态位宽度和养分供应来构建土壤真菌群落。在披碱草中，增施有机肥后，主要优势菌发生明显变化，赤霉菌属(Gibberella)相对丰度显著上升，亚隔孢壳属(Didymella)、裂殖壶菌属(Schizothecium)相对丰度明显下降，次要优势菌preussia(内生真菌属)和Fusarium(镰刀菌属)相对丰度出现上升趋势。

有机肥的应用可以导致土壤理化性质的变化，从而驱动微生物群落结构的变化[29]。施肥系统下的土壤微生物交换的组成在很大程度上与土壤化学性质有关[30]。研究表明，不同生态系统中的土壤微生物交换是由环境因素如pH、有机碳和有效磷决定的[31]，有人提出真菌群落结构与AP，SOM，TN显著相关[32]。本试验结果RDA (图4) 显示，在老芒麦中，主要优势属赤霉菌(Gibberella)与pH、株高、有机碳呈显著正相关(P<0.05)，其中pH对赤霉菌影响强度最强烈。这一结果进一步可以推测有机肥通过降低pH促使Gibberella相对丰度升高进一步促进牧草生长。作为子囊菌纲的亚隔孢壳属(Didymella)与地下生物量、SOC呈显著正相关，可见，Didymella对于促进牧草根系的发育有一定的积极作用。在披碱草中，Gibberella、Preussia、Fusicoua都与SOC、地下生物量、株高、TN呈显著正相关(P<0.05)，与硝态氮、铵态氮呈负相关；Gibberella、Preussia作为促进植物生长的有益真菌，对环境因子变化较为敏感，特别地，有机肥中富含的SOC和TN对Gibberella、Preussia的存活提供了正向促进作用。土壤真菌群落与pH、SOC、TN等土壤性质密切相关(图4)，表明施用有机肥调节土壤真菌群落主要是通过改变生境特征来实现的。施用有机肥直接增加了土壤中的碳库(表1)，有机肥对真菌类群的选择性影响较大，导致真菌群落组成成分发生变化(图3)，这可能是由于较高的碳输入量，RDA结果也显示SOC与真菌间有显著的相关性。

3.3 微生物网络共生关系对有机肥的响应

除了对真菌多样性的影响外，施肥还改变了物种组合。通过生态网络，我们发现施肥减少了真菌群落中的物种联结，在老芒麦中，表现得更为明显，有机肥降低了真菌群落的网络节点数(Total number of nodes)，使真菌群落比对照更加独立，有研究者发现肥料或有机肥所引起的养分含量的增加[33]，一般使贫营养类群富营养化，而使嗜粪类群稀释[34]。在披碱草中，有机肥的添加增加了稀有菌群间的联系性，值得注意的是，虽然有机肥增加了披碱草真菌网络的节点数(Total number of nodes)及密度，但主要优势菌与其他菌群间的联系被削弱。可见，有机肥对高寒地区牧草根际真菌群落网络共生关系因品种差异而影响不同，其中，有机肥均降低了优势菌群与其它菌之间的联系性，有机肥料的掺入重新构建了土壤真菌群落间的网络共生关系。

4 结论

高寒地区施用有机肥可以促进‘川草2号’老芒麦(Elymussibiricus‘Chuancao No.2’)和‘阿坝’垂穗披碱草(Elymusnutans‘Aba’)两种牧草的生长，改变茎叶比。有机肥的添加改变了土壤的基本化学性质，提升了有机碳储存量，降低土壤pH。有机肥处理明显改变了两种牧草根际微生物区系群落结构，降低了老芒麦根际真菌群落的平均相对丰度，增加披碱草根际赤霉菌属(Gibberella)、内生真菌(Preussia)等有益菌的丰度。有机肥的应用可以导致土壤理化性质的变化，其中pH和SOC为驱动的主要环境因子。施肥降低了优势物种与其他菌群间的网络共生关系，有机肥料的掺入重新构建了土壤真菌群落间的网络关系，缓解了真菌群落间的竞争压力。