不同紫花苜蓿品种光合生理特性差异及香豆素含量的变化

武 蓓， 师尚礼， 张辉辉， 张晓燕， 吴 芳， 王文娟， 何 龙， 刘旵旵

(甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心， 甘肃 兰州 730070)

紫花苜蓿(Medicagosativa)隶属于豆科苜蓿属，多年生草本植物，是我国广泛栽培的优良牧草，不仅可以作为优质的蛋白质饲草，而且能够改善生态环境，是人工草地栽培和天然草地改良的优势草种。然而，当紫花苜蓿用于生态草地建植时，其通过自身分泌、地上部淋溶及残体分解等方式从供体植株各器官向周围环境中释放自毒物质，直接或间接地对次代受体苜蓿种子萌发和幼苗生长产生抑制作用[1-2]，严重影响了放牧型生态草地群落更新的稳定性[3]，造成苜蓿生态草地的断崖式衰退。研究发现，萜类、生物碱及酚酸类物质等均是造成紫花苜蓿自毒作用的次生代谢物质[4-5]，且受到苜蓿本身遗传特性的影响，自毒物质种类和含量因苜蓿品种不同存在差异，其中香豆素是紫花苜蓿的主要自毒物质，在供体紫花苜蓿中含量最高[6]。荣思川和李志华等均对不同紫花苜蓿品种地上部和地下部主要酚酸类自毒物质含量进行测定，发现香豆素含量最高，且不同品种的不同部位自毒物质含量存在差异[7-8]。卢成等采用高效液相色谱法测定苜蓿酚酸类自毒物质的含量，表明香豆素、咖啡酸的含量相对较高[9]。而后有学者相继就香豆素对受体紫花苜蓿的自毒效应进行验证，通过外源添加自毒物质模拟试验均证明香豆素能抑制苜蓿种子萌发、根系形态建成和幼苗生长，对苜蓿植株的自毒效应最显著[10-11]。此外，香豆素作为紫花苜蓿的重要自毒物质，其含量受遗传因素、生态条件以及生长发育阶段等因素的影响，各因素对香豆素含量的影响都直接反映到苜蓿生理生化代谢上。因此，研究影响不同紫花苜蓿香豆素含量差异的内在理化因素对于阐明香豆素合成机理，进一步培育低香豆素含量的紫花苜蓿品种具有重要作用。

香豆素是一类来源于苯丙烷类代谢途径的次生代谢物，其合成是从光合作用产生蔗糖和淀粉等光合产物开始，后经蔗糖-淀粉代谢促进光合产物转化为葡萄糖，葡萄糖经过糖酵解和磷酸戊糖途径为莽草酸途径和苯丙烷类代谢物的合成提供能量和前体物质[12]。有关次生代谢物与光合作用之间关系的研究表明，莽草酸及苯丙烷等代谢过程与植物光合作用具有一定相关性[13]。Luo等通过对不同香豆素含量的草木樨种质进行转录组学分析，发现大部分差异表达基因富集在碳代谢以及碳代谢相关途径，如光合碳同化、糖酵解和淀粉-蔗糖代谢，且多数富集到这部分代谢途径的差异表达基因在香豆素含量高的种质中表达量上调[14]。程水源等从生理生化角度探究各指标与次级代谢产物含量的关系，发现叶绿素含量与黄酮含量呈负相关关系，色素的降解可以促进次级代谢物的合成[15]。随着植物体内自毒物质的积累，光合作用逐渐减弱，出现光能吸收、传递和转化过程减慢，光合速率下降等现象[16]。初生代谢产物可溶性糖和可溶性蛋白含量的变化会影响香豆素的合成，香豆素含量与可溶性糖含量的变化呈正相关关系，而蛋白质和香豆素由于存在共同前体物质苯丙氨酸，二者的关系有两种可能：竞争关系或者通过促进光合产物的转化而含量均提高[17]。近年来，有关自毒的研究多集中在不同植物各类自毒物质含量差异及次代植物对自毒胁迫的生理和分子响应等方面，但有关供体紫花苜蓿香豆素含量高低的内在影响因素以及香豆素合成机理的研究鲜有报道。紫花苜蓿品种差异是否影响其光合生理特性，进而影响香豆素的合成有待研究？因此，本研究在总结前人研究的基础上，从当代供体紫花苜蓿香豆素合成代谢途径角度出发，通过比较不同紫花苜蓿品种香豆素含量及光合生理差异，探究光合生理对香豆素含量的影响，为后续深入探讨高香豆素和低香豆素紫花苜蓿香豆素合成差异提供理论依据，同时也为培育低香豆素紫花苜蓿品种及解决苜蓿自毒障碍奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试紫花苜蓿品种：‘甘农9号’、‘陇东苜蓿’、‘陇中苜蓿’、‘MF4114’、‘MF4010’和‘3105c’均由甘肃农业大学草业学院草业生态系统教育部重点实验室提供；‘WL656HQ’购自北京正道生态科技有限公司；‘新牧4号’和‘清水苜蓿’由新疆农业大学提供。

1.2 试验方法

本试验采用营养液沙培法，于2021年3—4月在甘肃农业大学草业学院光照培养室培养苜蓿幼苗，光照培养室参数设置为光通量密度400 μmol·m-2·s-1，昼夜温度分别为(25±1)℃和(20±1)℃，相对湿度60%左右，每天光照14 h。将细沙经121℃高温灭菌26 min后，装入口径为9 cm，高度为11 cm的营养钵中，摆放在长×宽×高为25 cm×15 cm×10 cm的水培盒中。选取饱满且大小一致的不同品种紫花苜蓿种子，经0.1% HgCl2溶液消毒5 min后用蒸馏水冲洗干净，播种前用吸水纸吸干，均匀地播种在营养钵中，播种后置于光照培养室。出苗后间苗，每钵保留生长一致、分布均匀的幼苗10株，每隔2 d浇300 mL Hoagland营养液，保证幼苗正常生长。在出苗后第45 d采集苜蓿幼苗叶片，3次重复，液氮速冻后保存于-80℃冰箱，用于各项指标测定。

1.3 测定内容及方法

1.3.1香豆素含量的测定 采集好的苜蓿样品阴干粉碎后过1 mm筛子，室温保存用于香豆素含量测定。

香豆素的提取：参照汤春妮的方法稍有改进[18]。称取0.5 g待测样品于试管中，加入10 mL 60%的乙醇，摇匀后在30℃下超声提取40 min，上清液转移至10 mL离心管中，10 000 r·min-1离心5 min，取上清液至50 mL离心管中，重复提取3次，合并滤液，使用旋转蒸发仪将滤液浓缩至干。

香豆素含量的测定：采用分光光度法。浓缩后定容至50 mL的容量瓶中，374 nm处测定吸光值。

1.3.2光合参数的测定 采用德国GFS-3000便携式气体交换荧光系统于光照充足的上午9：00—11：00，测定供试苜蓿第3片完全展开真叶的光合参数。叶室温度为25℃，CO2浓度为380 μmol·m-2·s-1，光强为1 200 μmol·m-2·s-1，相对湿度60%左右。计算净光合速率(Pn)、蒸腾速率(E)、气孔导度(Gs)和胞间CO2浓度(Ci)[19-21]。各处理3次重复，每次重复取3个叶片进行光合参数的测定。

1.3.3叶绿素含量的测定 参照邹琦[22]的方法，采用丙酮乙醇混合液提取法，取苜蓿新鲜叶片，测定叶绿素a(Chla)、叶绿素b(Chlb)以及叶绿素(a+b)[Chl(a+b)]含量。各处理3次重复。

1.3.4光合产物的测定 取苜蓿新鲜叶片测定光合产物含量，各处理3次重复。

蔗糖(Suc)含量：采用蔗糖含量试剂盒(购于苏州格锐思生物有限公司)测定。

淀粉(Sta)含量：采用高氯酸水解-蒽酮比色法测定[23]。

可溶性糖(SS)含量：采用蒽酮比色法测定[24]。

可溶性蛋白(SP)含量：采用考马斯亮蓝G-250染色法测定[25]。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2010进行数据整理和计算；采用SPSS 19.0进行单因素方差分析和Pearson相关性分析，并用通径分析法分析供试紫花苜蓿品种光合生理相关指标对香豆素的直接效应。利用下列公式计算光合生理指标对香豆素含量的间接通径系数和决策系数。

间接通径系数的计算：

间接通径系数=rijPjy

(1)

式(1)中，间接通径系数rijPjy反映了自变量xi通过自变量xj对因变量y的影响效应，xi表示直接自变量，xj表示间接自变量。rij表示xi与xj的简单相关系数，Pjy表示自变量xj对因变量y的直接影响效应(即直接通径系数)。

决策系数：通径分析可以清楚地反映自变量对因变量的直接和间接作用，但难以确定自变量xi通过x1，x2，…，xj对y的综合决定作用。决策系数是通径分析中的决策指标[26]，表示各自变量对因变量的综合决定作用，决策系数最大的为主要决定因子，而决策系数为负值且最小的为主要限定因子[27]。计算采用公式为：

R2=2Piyriy-Piy2

(2)

式(2)中，Piy表示自变量xi对因变量y的直接影响效应(即直接通径系数)。riy表示自变量xi与因变量y的简单相关系数。R2可以是正数,也可以是负数，若R2>0,说明xi对y起增强作用；若R2<0,说明xi对y起限定性作用。

2 结果与分析

2.1 不同紫花苜蓿品种的香豆素含量差异

由图1可知，不同紫花苜蓿品种叶片中的香豆素含量存在差异。9个紫花苜蓿品种香豆素含量在12.08～20.12 mg·g-1之间，其中香豆素含量最高的是‘陇中苜蓿’，含量最低的是品种‘清水苜蓿’，‘陇中苜蓿’的含量仅为‘清水苜蓿’的60.06%，平均含量为16.98 mg·g-1，‘甘农9号’、‘陇东’、‘陇中’和‘MF4114’4个品种高于平均含量，分别较平均含量高了11.00%，0.70%，18.47%和16.27%，‘WL656’、‘新牧4号’、‘MF4010’、‘清水’和‘3105c’5个品种低于平均含量，分别较平均含量低了1.57%，2.21%，6.43%，28.85%和7.39%。‘陇中苜蓿’的香豆素含量显著高于‘WL656’、‘新牧4号’、‘MF4010’、‘清水’和‘3105c’(P<0.05)，分别高了20.35%，21.15%，26.61%，66.51%和27.92%。

图1 不同紫花苜蓿品种香豆素含量差异Fig.1 Differences of coumarin content in different alfalfa varieties注：不同小写字母表示不同品种间差异显著(P<0.05)，下同Note：Different lowercase letters indicate significant differences between different varieties at the 0.05 level,the same as below

2.2 不同紫花苜蓿品种的光合生理特性差异

2.2.1不同紫花苜蓿品种的气体交换参数差异 由图2可知，E和Gs值最高的是品种‘陇中苜蓿’，分别为3.85 mmol·m-2·s-1和103.28 mmol·m-2·s-1，最低的是‘MF4114’，分别为1.40 mmol·m-2·s-1和40.09 mmol·m-2·s-1，‘MF4010’的E和Gs值显著高于‘甘农9号’、‘WL656’、‘陇东’、‘MF4114’和‘MF4010’(P<0.05)。9个紫花苜蓿品种E的平均值为2.37 mmol·m-2·s-1，‘新牧4号’、‘陇中’、‘清水’和‘3105c’分别较平均值高了9.08%，11.75%，62.21%和51.67%，‘甘农9号’、‘WL656’、‘陇东’、‘MF4114’和‘MF4010’分别较平均值低了30.17%，35.76%，25.64%，40.96%和2.17%；Gs的平均值为67.68 mmol·m-2·s-1，‘新牧4号’、‘陇中’、‘清水’和‘3105c’分别较平均值高了7.98%，26.58%，52.59%和52.55%，‘甘农9号’、‘WL656’、‘陇东’、‘MF4114’和‘MF4010’分别较平均值低了29.01%，37.27%，26.12%，40.76%和6.54%。

Pn值最高的是‘MF4114’，为10.94 μmol·m-2·s-1，最低的是‘WL656’，为5.55 μmol·m-2·s-1，‘陇中苜蓿’的Pn值显著高于‘甘农9号’、‘WL656’、‘新牧4号’、‘陇东’、‘陇中’和‘3105c’(P<0.05)，Pn的平均值为7.51 μmol·m-2·s-1，‘MF4114’、‘MF4010’和‘清水苜蓿’分别较平均值高了45.72%，45.28%和3.19%，‘甘农9号’、‘WL656’、‘新牧4号’、‘陇东’、‘陇中’和‘3105c’分别较平均值低了25.85%，26.12%，5.65%，24.16%，4.76%和7.65%。

Ci值最高的是‘陇东苜蓿’，为612.14 μmol·mol-1，最低的是‘MF4114’，为209.15 μmol·mol-1，‘陇东苜蓿’与‘甘农9号’、‘WL656’、‘新牧4号’、‘陇中’、‘清水’和‘3105c’差异不显著，Ci值显著高于‘MF4114’和‘MF4010’(P<0.05)，‘MF4114’与‘MF4010’差异不显著，9个紫花苜蓿品种Ci的平均值为447.11 μmol·mol-1，‘甘农9号’、‘WL656’、‘新牧4号’、‘陇东’和‘陇中苜蓿’分别较平均值高了15.81%，22.82%，36.21%和0.80%，‘MF4114’、‘MF4010’、‘清水’和‘3105c’分别较平均值低了53.22%，45.87%，7.52%和5.93%。

图2 不同紫花苜蓿品种气体交换参数差异Fig.2 Differences of gas exchange parameters among different alfalfa varieties

2.2.2不同紫花苜蓿品种的叶绿素含量差异 由图3可知，Chla,Chlb和Chl(a+b)含量最高的品种是‘3105c’，分别为1.00 mg·g-1、0.54 mg·g-1和1.59 mg·g-1，Chla和Chl(a+b)含量最低的品种均为‘陇中苜蓿’，分别为0.82 mg·g-1和1.22 mg·g-1，Chlb含量最低的品种是‘清水苜蓿’，含量为0.37 mg·g-1。‘3105c’的Chlb含量显著高于‘陇东’、‘陇中’、‘MF4114’和‘清水苜蓿’(P<0.05)，9个紫花苜蓿品种Chlb的平均含量为0.42 mg·g-1，‘新牧4号’、‘MF4010’和‘3105c’较平均值分别高了8.02%，15.48%和26.37%，‘甘农9号’、‘WL656’、‘陇东’、‘陇中’、‘MF4114’和‘清水苜蓿’分别较平均值低了3.45%，2.44%，6.77%，13.11%，10.68%和13.42%。

‘陇中苜蓿’的Chla和Chl(a+b)含量显著低于‘新牧4号’、‘MF4010’和‘3105c’(P<0.05)，Chla的平均含量为0.90 mg·g-1，‘甘农9号’、‘新牧4号’、‘陇东’、‘MF4010’和‘3105c’较平均值分别高了1.63%，4.69%，0.61%，4.94%和11.32%，‘WL656’、‘陇中’、‘MF4114’和‘清水苜蓿’分别较平均值低了6.21%，8.98%，4.53%和3.48%；Chl(a+b)平均含量为1.36 mg·g-1，‘新牧4号’、‘MF4010’和‘3105c’较平均值分别高了5.81%，8.48%和16.38%，‘甘农9号’、‘WL656’、‘陇东’、‘陇中’、‘MF4114’和‘清水苜蓿’较平均值分别低了0.08%，4.94%，1.87%，10.36%，6.59%和6.82%。

图3 不同紫花苜蓿品种叶绿素含量差异Fig.3 Differences of chlorophyll content among different alfalfa varieties

2.2.3不同紫花苜蓿品种的光合产物含量差异 由图4可知，蔗糖含量最高的是‘MF4114’，为9.00 mg·g-1，含量最低的是‘甘农9号’，为4.91 mg·g-1，‘甘农9号’仅为‘MF4114’的54.53%，‘MF4114’的蔗糖含量显著高于其他8个品种(P<0.05)。9个紫花苜蓿品种蔗糖含量的平均值为6.38 mg·g-1，‘WL656’、‘新牧4号’、‘陇东’和‘MF4114’较平均值分别高了22.63%，9.94%，4.82%和41.15%，‘甘农9号’、‘陇中’、‘MF4010’、‘清水’和‘3105c’较平均值分低了23.03%，4.14%，14.25%，15.32%和21.80%。

淀粉含量最高的是‘WL656’，为28.07 mg·g-1，含量最低的是‘新牧4号’，为9.09 mg·g-1，‘WL656’的淀粉含量显著高于其他品种(P<0.05)。淀粉含量的平均值为13.54 mg·g-1，‘甘农9号’和‘WL656’较平均值分别高了13.25%和107.28%，‘新牧4号’、‘陇东’、‘陇中’、‘MF4114’、‘MF4010’、‘清水’和‘3105c’较平均值分别低了32.92%，16.98%，14.30%，5.29%，15.34%，19.60%和16.10%。

可溶性糖含量最高的是‘MF4010’，为8.35 mg·g-1，含量最低的是‘3105c’，为6.95 mg·g-1，‘陇东’和‘MF4010’的可溶性糖含量显著高于‘WL656’、‘MF4114’、‘清水’和‘3105c’(P<0.05)，‘甘农9号’显著高于‘MF4114’、‘清水’和‘3105c’(P<0.05)。可溶性糖含量的平均值为7.62 mg·g-1，‘甘农9号’、‘新牧4号’、‘陇东’、‘陇中’和‘MF4010’较平均值分别高了6.23%，2.79%，8.95%，3.58%和9.53%，‘WL656’、‘MF4114’、‘清水’和‘3105c’较平均值分别低了5.58%，8.50%，8.21%和8.78%。

可溶性蛋白含量最高的是‘MF4010’，为75.68 mg·g-1，含量最低的是‘陇中苜蓿’，为64.13 mg·g-1，‘陇中苜蓿’的可溶性蛋白含量显著低于‘甘农9号’、‘新牧4号’、‘陇东’和‘MF4010’(P<0.05)。可溶性蛋白含量的平均值为69.09 mg·g-1，‘甘农9号’、‘新牧4号’、‘陇东’和‘MF4010’较平均值分别高了0.61%，1.88%，3.31%和9.53%，‘WL656’、‘陇中’、‘MF4114’、‘清水’和‘3105c’较平均值分别低了0.28%，7.18%，6.25%，1.00%和0.63%。

图4 不同紫花苜蓿品种光合产物含量差异Fig.4 Differences of photosynthetic product content among different alfalfa varieties

2.3 光合生理指标对香豆素含量影响的综合分析

2.3.19个紫花苜蓿品种光合生理指标及香豆素含量的相关性分析 供试9个紫花苜蓿品种的光合生理相关指标及香豆素含量的相关性分析结果见表1。结果表明：香豆素含量与E相关系数为-0.675，呈显著负相关(P<0.05)；E与Gs相关系数为0.985，呈极显著正相关(P<0.01)；Pn与Ci相关系数为-0.910，呈极显著负相关关系(P<0.01)，香豆素含量与Gs和Ci呈正相关关系。Chla含量与Chlb含量和Chl(a+b)含量均呈极显著正相关(P<0.01)，相关系数分别为0.889和0.969；Chlb含量与Chl(a+b)含量的相关系数为0.974，呈极显著正相关(P<0.01)，香豆素含量与Chla、Chlb和Chl(a+b)呈负相关关系。除此之外，香豆素含量与蔗糖、淀粉和可溶性糖含量呈正相关关系，与可溶性蛋白含量呈负相关关系。

表1 紫花苜蓿品种光合生理及香豆素含量的相关性分析Table 1 Correlation analysis of photosynthetic physiology and coumarin content in alfalfa varieties

2.3.29个紫花苜蓿品种光合生理指标与香豆素含量作用的通径分析 通径系数是标准化的偏回归系数，而且消除了各指标变异幅度不同造成的影响，能够客观地评价光合指标对香豆素含量的影响。故本试验为了探究各光合生理指标对香豆素含量的影响大小，对9个紫花苜蓿品种的香豆素含量和其他11个光合相关指标进行通径分析。结果见表2，通径分析排除了气孔导度、叶绿素a和叶绿素(a+b)三个指标对香豆素含量的影响，剩余8个指标根据直接通径系数的绝对值大小可以得出，对香豆素含量的影响程度从大到小依次为：可溶性蛋白(SP)>可溶性糖(SS)>蒸腾速率(E)>叶绿素b(Chlb)>净光合速率(Pn)>蔗糖(Suc)>胞间CO2浓度(Ci)>淀粉(Sta)。SS和Chlb对香豆素产生较大的正向作用，直接通径系数分别为0.681和0.510，其中SS的直接正效应最大；E和SP对香豆素产生较大的负向作用，其中SP对香豆素的直接负效应最大，直接通径系数为-1.154。

SS和Chlb均通过SP对香豆素产生较大的间接负效应，间接通径系数分别为-0.622和-0.646，且Chlb的负效应最大，但与直接作用相比，Chlb通过SP产生的间接作用大于Chlb的直接作用，SS通过SP产生的间接作用则小于SS的直接作用，说明香豆素主要受Chlb通过SP的间接作用以及SS的直接作用。而Suc和SP分别通过SP和SS对香豆素产生较大的间接正效应，间接通径系数分别为0.427和0.381，且Suc产生的正效应最大，但与直接作用相比，Suc通过SP产生的间接作用大于Suc的直接作用，SP通过SS产生的间接作用则小于SP的直接作用，说明香豆素主要受Suc通过SP的间接作用以及SP的直接作用。其次，本试验8个光合生理指标分别通过其他指标产生的间接效应从大到小依次为Chlb>SP>Suc>SS>Pn>Sta>Ci>E。综上所述，SS和SP是影响香豆素含量的主要直接因素，Chlb和Suc通过SP间接影响香豆素含量。

本试验8个光合生理指标的决策系数从大到小依次为：E>Ci>Sta>Pn>Suc>SS>SP>Chlb，E、Ci和Sta的决策系数均大于0，其中E的决策系数最大，为0.455，是香豆素的主要决定因子；Pn,Suc,SS,SP和Chlb的决策系数均小于0，其中Chlb的决策系数最小，为-0.503，是香豆素的主要限定因子。

3 讨论

3.1 光合生理指标与香豆素含量的关系

香豆素是紫花苜蓿的主要自毒物质[28]，其含量的高低受土壤状况、温度、水分状况、苜蓿株龄和自身遗传特性等因素的影响[29-30]，各因素对香豆素含量的影响都直接反映到生理生化代谢上。近年来，众多学者研究各生理生化指标(如光合生理相关指标)与香豆素等苯丙烷类次生代谢物含量的关系，发现植物的光合作用与苯丙烷类代谢过程具有一定的相关性[31]。E,Gs,Pn,Ci能够反映植物光合能力的强弱，叶绿素是植物光合作用光能传递、分配和转化过程的重要物质[32]，自毒物质含量的高低与叶绿素的合成与分解有关，叶绿素的降解有利于黄酮的合成[15]。自毒物质的积累造成PSⅡ反应中心和电子传递被破坏，植物光合作用进程减慢[33]。已有研究表明自毒物质肉桂酸的积累会使植物叶绿素含量、蒸腾速率、气孔导度和净光合速率下降，胞间CO2浓度显著上升[34-35]。此外，刘健伟通过测定茶树在不同氮素条件下黄酮类次级代谢产物含量以及光合作用的变化，发现随着氮素的升高叶绿素含量升高，光合作用增强，导致次级代谢物合成受阻，花青素含量下降[36]。本研究发现，‘清水苜蓿’香豆素含量最低，‘陇中苜蓿’香豆素含量最高，其E、Gs和Pn值低于‘清水苜蓿’，Ci值则相反，香豆素含量与E呈显著负相关关系，Gs与E呈显著正相关关系，Gs的降低引起E和Pn的降低，同时伴随着Ci值升高，Pn与Ci呈显著负相关，Chla含量和Chl(a+b)含量均表现出‘陇中苜蓿’低于‘清水苜蓿’，二者呈显著正相关关系。与前人研究结果一致，说明高含量香豆素的合成伴随着紫花苜蓿光合作用进程减慢以及叶绿素合成减少，原因可能是紫花苜蓿香豆素合成过程中存在一定的负反馈调节，‘陇中苜蓿’相较‘清水苜蓿’积累了更多香豆素，故通过减少叶绿素合成以及降低蒸腾速率等降低自身光合能力来适应自毒物质香豆素的不断积累，使植物个体机体维持稳态。

表2 紫花苜蓿品种光合生理与香豆素含量作用的通径分析Table 2 Path analysis of photosynthetic physiology and coumarin content in alfalfa varieties

蔗糖、淀粉是植物光合作用生成的初级产物，光合初级产物进一步转化为脂肪和蛋白质等初生代谢产物，初生代谢产物通过光合作用和三羧酸循环等代谢途径为香豆素等次生代谢物的生成提供能量和一些小分子化合物原料[37]。许多研究表明光合产物与自毒物质有密切关系，刘健伟通过测定春季不同时期茶树叶片碳水化合物和黄酮类物质含量发现，随着叶片生长发育糖类物质含量大大降低，同时黄酮类化合物含量也明显降低[36]。香豆素类化合物和黄酮一样都是以碳为基础的酚酸类次生代谢产物，它们的生物合成需要在充足的糖类供应情况下得到加强。糖类也可以作为信号分子，调节酚酸类物质合成过程中的多种基因表达[39]。孙天宇通过对不同生育期老山芹香豆素和光合产物含量的测定以及相关性分析，发现其生育中期光合能力较强，初生代谢活跃，合成较多碳水化合物，促进次级代谢物香豆素的积累，香豆素含量的变化与可溶性糖、淀粉呈正相关关系[17]。而蛋白质与香豆素的合成可能存在两种关系，竞争关系或者当前体物质含量较高时，由于竞争同一底物促进光合产物转化而含量均提高。本试验中，通过测定9个紫花苜蓿品种叶片蔗糖、淀粉、可溶性糖和可溶性蛋白含量，发现‘陇中苜蓿’的香豆素、蔗糖、淀粉和可溶性糖含量均高于‘清水苜蓿’，但可溶性蛋白含量低于‘清水苜蓿’，且蔗糖、淀粉和可溶性糖与香豆素含量呈正相关关系，可溶性蛋白含量与香豆素含量呈负相关关系，与前人研究结果一致，这说明‘陇中苜蓿’较高含量的蔗糖、淀粉和可溶性糖与香豆素的积累有密切关系，作为光合作用初级产物，高含量的蔗糖和淀粉分解产生更多葡萄糖，促进糖酵解和磷酸戊糖途径等初级代谢，为香豆素类化合物的合成提供较多底物和能量，如莽草酸和苯丙氨酸等。而本试验中香豆素含量和可溶性蛋白含量负相关的原因可能是苯丙氨酸作为香豆素和蛋白质合成的共同底物，出现底物竞争的现象。

3.2 光合生理对香豆素含量影响的综合讨论

香豆素的合成是以莽草酸途径生成的苯丙氨酸为次生代谢的初始底物[38]，受到光合作用、碳氮代谢、莽草酸途径以及苯丙烷类代谢等多步生理生化反应的调控，要想选育低香豆素品种，首先必须明确香豆素合成过程中关键物质对香豆素含量的影响。简单相关性分析虽然能得出光合生理指标对香豆素含量的影响程度和性质，但不能清楚地反映自变量对因变量的直接和间接作用，从而直接比较各因素的相对重要性，而通径分析是1921年由美国学者赖特创立的一种利用通径系数分析变量间因果关系程度的多元统计分析方法[40]，能够达到更全面、准确分析光合生理指标对香豆素含量影响的目标。本试验对不同紫花苜蓿品种香豆素含量以及光合生理相关指标进行通径分析，结果表明：叶绿素b(Chlb)、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)和蔗糖(Suc)对香豆素产生较大的直接作用和间接作用。另有研究指出，可溶性糖和可溶性蛋白是影响次生代谢物含量的重要光合生理指标[15]，叶绿素含量的高低影响次生代谢产物的含量[17]，本试验与前人的研究结果一致。SP对香豆素的直接负效应最大，通过SS对香豆素产生的间接正效应小于SP的直接效应；SS对香豆素直接正效应最大，通过其他光合指标对香豆素产生的间接作用均小于其直接作用，SS对香豆素的作用程度小于SP。Chlb对香豆素产生的间接负效应最大，通过SP对香豆素产生的间接作用大于Chlb的直接作用，Suc对香豆素产生的间接正效应最大，通过SP对香豆素产生的间接作用大于Suc的直接作用。总体而言，SP和SS主要通过直接作用影响香豆素含量，Chlb和Suc主要以通过SP产生的间接作用的方式影响香豆素含量。此外，为了得到各个光合生理指标对香豆素含量的综合决定作用强弱，本试验通过计算决策系数将光合生理指标对香豆素的综合作用进行排序，结果表明：蒸腾速率、胞间CO2浓度和淀粉的决策系数为正值，对香豆素起增强作用，其中蒸腾速率的决策系数最大，为香豆素的主要决定因子；净光合速率、叶绿素b、蔗糖、可溶性糖和可溶性蛋白的决策系数为负值，对香豆素起限定性作用，其中叶绿素b的决策系数最小，为香豆素的主要限定因子。

4 结论

‘陇中苜蓿’香豆素含量显著高于‘清水苜蓿’，较高含量的蔗糖、淀粉和可溶性糖为香豆素的合成提供初始底物，可溶性蛋白与香豆素的合成存在竞争关系，二者呈负相关关系。‘陇中苜蓿’还通过减少叶绿素合成以及降低蒸腾速率来适应香豆素的积累。此外，可溶性蛋白、可溶性糖、叶绿素b和蔗糖是影响香豆素含量的主要光合生理指标，可溶性蛋白和可溶性糖通过直接作用影响香豆素含量，叶绿素b和蔗糖对香豆素含量的影响来自通过可溶性蛋白产生的间接作用。蒸腾速率是香豆素的主要决定因子，叶绿素b是香豆素的主要限定因子。