萝卜花青素研究进展

刘同金 李锡香 刘良峰 张爱慧 崔群香 王长义*

（1 金陵科技学院园艺学院，江苏南京 210038；2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；3 江宁区农业农村局，江苏南京 211100）

萝卜（L.，2=2=18）又名莱菔、芦菔，是十字花科萝卜属重要蔬菜作物，具有较高的营养价值和药用食疗价值。萝卜种质资源丰富，栽培历史悠久，经过长期自然选择和人工选择，形成了不同皮色、肉色的类型和品种。其中，富含花青素的萝卜品种因色泽鲜艳、营养价值高而深受广大消费者喜爱。萝卜花青素在较宽的pH 范围内均能保持鲜艳的亮红色，且在酸性条件下具有良好的热稳定性（Jing et al.，2012），加之具有较强的抗氧化活性而有益人类健康，已被广泛用作天然色素（Rahman et al.，2006；Matsufuji et al.，2007）。

萝卜花青素性状遗传复杂。何启伟等（1997）研究表明，萝卜肉质根的红皮性状可能由3 对独立遗传的基因控制，这3 对基因还存在相互作用，其中1 对可能与控制肉质根绿皮性状的基因连锁。王岩等（2014）以红皮萝卜和心里美萝卜杂交进行6世代联合分析研究心里美萝卜肉色遗传规律，发现其肉色为主基因+多基因控制的数量性状，符合2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性-上位性多基因模型（E 模型）。李鸿渐等（1983）的研究也表明，紫肉基因不仅控制萝卜肉质根的肉色，而且对皮色及叶片主脉颜色也产生影响。心里美与绿皮绿肉或白皮白肉萝卜品种杂交时，肉质根皮色表现为紫红色或浅紫红色，说明紫红肉基因在杂交过程中对皮色也产生了影响，其遗传规律比较复杂（张丽，2006）。萝卜花青素的合成调控机制仍不明确，与拟南芥、苹果、梨等作物相比，萝卜相关研究严重滞后，制约了其育种进程。本文对近年来萝卜中花青素的种类鉴定，花青素合成结构及调控基因的鉴定和克隆，影响萝卜花青素合成的因素及花青素提取工艺方面取得的进展进行综述，以期为萝卜花青素形成机制的解析和新品种的选育提供参考。

1 萝卜花青素的种类

花青素是植物中普遍存在的一类水溶性黄酮类化合物，种类繁多。迄今已知的花青苷种类超过600 种（Grotewold，2006），多数是由天竺葵色素（pelargonidin）、矢车菊色素（cyanidin）、飞燕草色素（delphinidin）、芍药花色素（peonidin）、矮牵牛色素（petunidin）、锦葵色素（malvidin）等6 种常见的花青素衍生而来。萝卜肉质根的皮色和肉色变异丰富，花青素种类多样。迄今为止，不同研究者通过HPLC-MS、HPLC-ESI-MS、HPLC-DAD、HPLC-PDA-ESI/MS、超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱、一维和二维核磁共振等技术在不同类型的萝卜中共鉴定出至少234种花青苷，其中145 种为矢车菊色素类，81 种为天竺葵色素类，4 种为飞燕草色素类，3 种为芍药花色素类，1 种为矮牵牛色素-3，5-双葡萄糖苷（Giusti et al.，1998；Otsuki et al.，2002；Matsufuji et al.，2003；Liu et al.，2008；Tatsuzawa et al.，2008，2010；Tamura et al.，2010；Lin et al.，2011；Park et al.，2011；Jing et al.，2012；Matera et al.，2012；Baenas et al.，2015；Chen et al.，2018；Zhang et al.，2019a；Koley et al.，2020）。多数红色萝卜品种以天竺葵色素苷元为主（Park et al.，2011；Jing et al.，2012；Yi et al.，2018），紫色萝卜以矢车菊色素苷元为主（Masukawa et al.，2019），仅少数研究者报道萝卜中还存在飞燕草色素苷元、芍药花色素苷元和矮牵牛色素苷元（Baenas et al.，2015；Zhang et al.，2019a）。

2 萝卜花青素合成途径及其相关基因

花青素合成途径是迄今为止研究得最为清楚的植物次生代谢途径之一，其合成起始于苯丙氨酸，经多步酶促反应生成。苯丙氨酸经苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4-羟基化酶（C4H）和4-香豆酸辅酶A 连接酶（4CL）催化生成4-香豆酰辅酶A，在查尔酮合成酶（CHS）作用下与丙二酰辅酶A 生成查尔酮，依次经黄烷酮3-羟化酶（F3H）、二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）和花青素合成酶（ANS）形成不稳定的无色花青素苷元后，由糖基转移酶催化以UDP-糖为供体形成稳定的花青素苷，在相关酶的作用下进一步二次糖基化、乙酰化、异戊烯化和甲氧基化修饰而形成不同种类的花青素苷（戴思兰和洪艳，2016）。目前，萝卜花青素合成途径多个候选基因已被报道。转录组分析推测-、、-和--可 能 参与了萝卜花青素的糖基化修饰（Gao et al.，2019a，2020a）。通过转录组和qRT-PCR 对不同类型萝卜中相关基因的表达分析发现，萝卜花青素合成与、、、、和′的表达相关（Park et al.，2011；孙玉燕等，2016；Chen et al.，2016；Muleke et al.，2017；Sun et al.，2018；Gao et al.，2019a，2020a；Liu et al.，2019a；Yu et al.，2020）。花青素生物合成途径上的柚皮素和二氢黄酮醇是两个关键的分支节点。柚皮素是黄烷酮3-羟化酶（F3H）、类黄酮3′-羟化酶（F3′H）和类黄酮3′，5′-羟化酶（F3′5′H）共同的底物，这3 个酶的竞争导致了不同分支途径的产生；F3H 是合成天竺葵色素的关键酶，矢车菊色素及飞燕草色素的合成分别需要F3′H 和F3′5′H 的参与（Koes et al.，2005）。黄酮醇合成酶（FLS）催化二氢黄酮醇合成黄酮醇，与合成无色花青素苷元的DFR 竞争同一底物，影响植物组织或器官的呈色和黄酮醇的含量（Davies et al.，2003；Tsuda et al.，2004）。紫色萝卜由于′的表达而主要合成矢车菊色素，红色萝卜该基因第一外显子由于1 个反转录转座子的插入导致不表达而积累天竺葵色素（Masukawa et al.，2018），并据此开发了用于筛选红色肉质根萝卜的分子标记（Masukawa et al.，2019）。然而，上述候选基因在花青素生物合成过程中的确切功能仍需进一步的试验验证。

花青素在细胞质中合成后，转运并储存于液泡而影响植物的呈色（戴思兰和洪艳，2016）。拟南芥中GST 基因家族成员参与了花青素的转运（Sun et al.，2011）。萝卜GST 基因家族包含82 个成员，表达分析发现-和-可能参与了胭脂萝卜花青素的转运（Gao et al.，2020b）。Liu 等（2019a）在心里美萝卜中鉴定出了的同源基因，其表达趋势与花青素合成途径关键基因一致，推测该基因参与了萝卜花青素的转运。拟南芥MATE 基因家族成员参与了原花青素的转运（Marinova et al.，2007）。M’mbone 等（2018）通过 系 统进化树和表达分析发现萝卜MATE 基因家族成员、、、和可能参与了萝卜花青素的转运。然而Liu等（2019a）发现的同源基因在心里美肉质根中不表达。不同研究者因试验材料的不同而预测出了不同的基因参与萝卜花青素亚细胞水平的转运，而这些基因均未被进行功能验证，萝卜花青素的转运机制至今仍不明确。

过氧化物酶（POD）参与花青素的降解过程（Zipor et al.，2015）。心里美萝卜POD 活性与花青素含量密切相关（王丽 等，2009），萝卜POD在体外能降解花青素（Wang et al.，2004），而抑制POD 编码基因的表达能够促进萝卜花青素的积累（穆春 等，2013）。

3 萝卜花青素合成的调控

目前花青素生物合成途径的遗传调控研究主要集中于转录水平的调控、转录后水平的调控和表观遗传调控3 个方面。

花青素合成受多个转录因子的调控，由R2R3-MYB、bHLH 和WD40 转录因子组成的蛋白复合体（MBW）与结构基因的启动子结合，普遍参与植物花青素合成的调控（Ramsay &Glover，2005）。是调控拟南芥花青素生物合成的一个关键转录因子，研究发现其在萝卜中的同源基因普遍参与萝卜花青素合成的调控，通过在拟南芥、烟草和矮牵牛中异源过表达的方法证明是调控花青素合成的一个关键转录因子（Lim et al.，2016；Ai et al.，2017）。Yi 等（2018）定位获得了控制萝卜肉质根红皮的关键基因。Wang 等（2020a）结合QTL-seq 和RNA-seq 技术定位获得了控制心里美萝卜肉质根根肉花青素生物合成的关键基因，并验证了该基因的功能。Liu 等（2019b）利用QTL-seq 和传统定位方法鉴定出了控制萝卜肉质根紫皮性状的关键基因，并在萝卜基因组中鉴定出拟南芥的4 个同源基因（～），推测它们分别控制不同类型萝卜花青素的合成。Muleke 等（2021）也发现，的同源基因、和在红皮萝卜肉质根根皮中高表达，而和在紫皮萝卜肉质根根皮中高表达，推测这些基因参与了调控萝卜肉质根花青素的合成。Luo 等（2020）利用不同的定位群体构建高密度遗传图谱，定位获得了控制萝卜肉质根红皮性状的关键基因。萝卜bHLH转录因子RsTT8 与RsMYB1 互作正向调控花青素的 合 成（Lim et al.，2017；Lai et al.，2020）。Fan等（2019）分析发现萝卜39 个花青素合成相关基因启动子区均包含bZIP 转录因子结合位点G-box或ACE-box，表达分析推测萝卜135 个bZIP 基因家族成员中的2 个（和）可能参与花青素生物合成的调控。转录组分析发现WRKY、ERF、GRAS、NF-YA、C2H2-Dof、HDZIP、AP2、锌指蛋白、Tify、HB 和LBD 基因家族的部分成员可能参与了萝卜花青素生物合成的调控（Sun et al.，2018；刘同金 等，2019；Gao et al.，2019b，2020a；Yu et al.，2020）。这些转录因子的功能均有待进一步的功能验证。

花青素生物合成途径的转录后调控包括蛋白质泛素化、miRNA 及小干扰siRNA 介导的转录后基因沉默3 个方面，目前在萝卜中的研究仍停留在通过高通量测序预测花青素合成相关的miRNA。Sun 等（2017）对心里美萝卜5 个不同发育时期的肉质根进行miRNA 测序，预测72 个miNRA 参与了心里美萝卜花青素合成的转录后调控。利用上述miRNA 数据，Gao 等（2019b）预测出74 个miRNA 可能参与胭脂萝卜花青素合成的调控。

在表观遗传调控方面，花青素合成途径结构基因及调控基因DNA 甲基化影响花青素的合成。目前萝卜花青素生物合成在表观遗传调控方面的研究比较少，仅Wang 等（2020a）发现心里美萝卜花青素合成关键调控基因启动子甲基化导致白肉突变体的出现。

4 影响萝卜花青素合成的因素

除遗传因素外，花青素的生物合成作为植物的次生代谢途径，受光照、植物激素、外源性糖、营养元素、非生物胁迫等多种因素的影响。有研究表明，在海南省种植的胭脂萝卜色素含量仅为涪陵本地同期栽培的1/4（高家祥，2012）。外源物质处理对萝卜尤其是萝卜芽苗菜花青素合成的影响已有较多的研究。

4.1 光照

萝卜花青素的积累受光照强度的影响，茉莉酸和NaCl 协同处理条件下萝卜（cv.Taibyo-Soubutori）芽苗菜花青素含量随光照强度增加而升高，但对照花青素含量不受光照的影响（Sakamoto&Suzuki，2019）。其他研究者发现萝卜（L.var）种子黑暗萌发3 d 后持续光照处理，下胚轴花青素含量迅速升高，至第4 天时含量最高，之后呈下降趋势（Song et al.，1998）。Park 等（2013）发现萝卜（cv.Jukwhan 21 Moo）种子萌发前期进行光照处理的下胚轴花青素含量显著高于黑暗处理，但第9 天之后二者差异不显著。说明不同萝卜品种花青素合成对光照的响应不同。Al-Dhabi 等（2015）和Zhang 等（2019b）也发现，光照较黑暗处理显著增加萝卜幼苗花青素的积累。此外，光质对萝卜花青素合成具有较大影响。远红光处理能显著增加萝卜幼苗花青素的积累（Bellini &Martelli，1973）。蓝光、UV-A 和UV-B 处理，萝卜芽苗菜花青素含量显著高于白光及黑暗处理（Su et al.，2015；Wu et al.，2016；Zhang et al.，2018；Zhang et al.，2019a）。UV-B 处理停止后，其对萝卜花青素合成的诱导作用和相关基因表达的影响仍能持续一段时间（Su et al.，2015），这可能是由于UV-B 通过诱导萝卜产生HO和NO 而激活依赖UVR8 的信号转导途径进而调控花青素的合成（Wu et al.，2016）。

4.2 植物激素

研究表明，外源激素单独或与其他因素协同均可影响萝卜花青素的积累。茉莉酸甲酯和光照协同处理的萝卜下胚轴花青素含量显著高于单独光照、黑暗和茉莉酸甲酯处理（Park et al.，2013；Al-Dhabi et al.，2015）。而Sakamoto 和Suzuki（2019）研究表明，茉莉酸甲酯处理可以显著增加萝卜芽苗菜下胚轴中的花青素含量，茉莉酸甲酯和NaCl 协同处理对下胚轴花青素合成的诱导效果最显著。外源赤霉素（GA）处理抑制萝卜芽苗菜花青素合成而矮壮素处理促进花青素合成；GA的抑制作用可被矮壮素逆转，它们主要是通过影响花青素合成的前体物质的含量而进一步影响花青素合成（Jain &Guruprasad，1989）。王丽等（2016）也发现，1 μmol·L外源GA处理显著降低萝卜下胚轴花青素含量。

4.3 糖

糖是生物体内一种重要的信号分子，参与调控花青素生物合成等多种生物过程，也是花青素糖基化修饰的底物。通过HPLC 对195 份不同肉色萝卜肉质根糖含量测定发现，萝卜肉质根积累的可溶性糖主要为葡萄糖，可溶性糖质量分数与萝卜肉质根肉色呈显著相关，绿肉萝卜肉质根可溶性糖含量最高，红肉萝卜次之，白肉萝卜最低（Li et al.，2020）。播种35 d 内红皮萝卜肉质根花青素含量持续增加，与肉质根葡萄糖的积累趋势一致；外源葡萄糖、果糖和蔗糖处理均能显著诱导花青素合成途径基因的上调表达而增加萝卜下胚轴花青素含量，但甘露糖和3--甲基葡萄糖处理无明显效果（Hara et al.，2003；贾晓琳，2013；Wang et al.，2020b）。

4.4 其他因素

低浓度NaCl 处理对萝卜芽苗菜下胚轴花青素含量无显著影响，而300 mmol·LNaCl 处理显著增加了其花青素含量（Sakamoto &Suzuki，2019）。Wu 等（2016）也发现NaCl、铬和低温处理均能显著增加萝卜下胚轴花青素含量，它们对花青素合成的诱导需要光照。研究者发现，富氢水能显著提高萝卜幼苗花青素的积累。富氢水和蓝光共同处理萝卜幼苗，其矢车菊色素和矮牵牛色素-3，5-双葡萄糖苷含量分别比单独蓝光处理增加了1.50 倍和1.35 倍；富氢水和UV-A 共同处理的矢车菊色素-3-芸香糖苷-5-葡萄糖苷和矢车菊色素-3-葡萄糖苷含量分别比单独UV-A 处理增 加了1.09 倍 和1.27 倍（Zhang et al.，2019a）。转录组测序分析表明，MBW 蛋白复合体成员基因、NAC、bZIP 和TCP 转录因子参与了富氢水诱导的花青素积累，MBW 蛋白复合体成员基因、植物激素、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和Ca信号途径参与了富氢水和UV-A 协同对萝卜芽苗菜下胚轴花青素合成的诱导（Zhang et al.，2018）。缺氮条件下萝卜芽苗菜下胚轴花青素和可溶性糖（尤其是蔗糖）含量显著上升，而外源3-（3，4-二氯苯基）-1，1-二甲基脲阻断糖生物合成途径会抑制氮素缺乏对花青素合成的诱导作用；磷、硫、钾、钙、镁等元素缺乏对花青素含量无显著影响（Su et al.，2016）。

5 萝卜花青素提取工艺

萝卜中提取的花青素稳定性高，其特性与人工色素Food Red No.40 类似（Rodriguez-Saona et al.，2010），安全无毒，原材料资源丰富，产品价格低廉，且具有多种保健功能，已作为天然食用色素被广泛用作各种食品、饮料和化妆品等的着色剂和添加剂（Rodriguez-Saona et al.，1999；He &Giusti，2010；时建伟 等，2016）。研究者对萝卜花青素的提取方法及纯化条件进行了不少探索。红皮红肉的胭脂萝卜在所有红色萝卜中花青素含量最高，是提取花青素的理想材料（张晓光，2009；时建伟 等，2016）；以其为材料进行花青素的提取、分离和精制研究取得了令人瞩目的进展。时建伟等（2016）和熊玥等（2018）系统总结了胭脂萝卜红色素提取分离工艺的发展及其色素稳定性和脱除萝卜味方面的研究进展。近几年，研究者进一步优化了胭脂萝卜花青素的提取工艺。梁姗等（2017a）研究表明，AB-8 树脂是胭脂萝卜花青素的最佳纯化树脂；进一步优化胭脂萝卜花青素的提取工艺，发现以1%盐酸乙醇为提取剂，液料比10∶1（质量比），40℃浸提2 h，400 W 超声波破碎15 min，花青素的最高提取量为3.92 mg·g（梁姗 等，2017b）；而在果胶酶与纤维素酶比例1∶2（质量比），添加量0.03 mg·g，50 ℃，酶解pH 4.0，酶解95 min条件下，花青素的最高提取量达4.25 mg·g（梁姗 等，2017c）。熊勇等（2019）优化了胭脂萝卜提取工艺，提取温度43.07 ℃，pH 2.88，提取时间3.65 h，料液比为1∶4（质量比）条件下花青素提取率为65.21%。此外，还有研究者对心里美萝卜和黑萝卜花青素提取工艺进行了研究。仉晓文等（2013）研究表明，0.1%盐酸浸提液对心里美萝卜肉质根花青素提取效果最好，AB-8 大孔吸附树脂纯化花青素的效果较好，花青素在pH 7.0 缓冲液混合0.5 mmol·LFe时最稳定，10 min 内的残留量保持在90%左右。杨艳等（2014）研究表明，在浸提温度60 ℃，浸提时间2.5 h，液料比5∶1（质量比），浸提液pH 2.0 条件下，黑皮白肉萝卜肉质根根皮中花青素的提取率可达6.82 mg·g。

6 展望

富含花青素的萝卜品种不仅外观品质好，而且具有较高的营养和价值，萝卜源花青素也是GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》允许使用的天然着色剂之一，具有安全系数大、营养价值高、生产成本低等特点，被广泛应用于食品、化妆品、医药等领域（熊玥 等，2018），引起了研究者的广泛关注。近年来，萝卜花青素种类鉴定、提取纯化方面研究的进展较大；施用外源物质提高萝卜芽苗菜的花青素含量亦有较多研究。但与其他作物相比，萝卜花青素的合成调控机制研究不够深入。综述前人对萝卜花青素相关的研究与利用进展，建议今后在以下几个方面进一步深入研究：

①萝卜花青苷种类有待进一步确认。据笔者统计，目前为止已报道的萝卜花青苷种类至少有234 种，但其中仅有少部分在不同的研究中被重复鉴定，除部分研究的试验材料差异原因外，主要是因为通过代谢组数据库比对获得的花青素结构准确性有待验证。

②挖掘和克隆控制萝卜花青素合成、转运和降解相关基因及其调控基因，解析其调控机制。目前通过转录组测序鉴定萝卜花青素合成基因研究较多，但功能研究较少。已进行功能验证的基因仅R2R3-MYB 转录因子和bHLH 转录因子，其他基因的研究均局限于同源克隆、表达分析与生物信息学的推理阶段，功能有待进一步的试验验证。

③解析花青素合成的转录后水平调控机制。虽然研究者通过高通量测序预测了可能参与心里美和胭脂萝卜花青素合成的miRNA（Sun et al.，2017；Gao et al.，2019b），但 在 萝 卜 中 尚 未 见miRNA 调控花青素合成功能验证的报道。蛋白质泛素化及小干扰siRNA 介导的转录后调控在萝卜中也未见相关研究。近年来在其他植物中新发现长链非编码RNA（lncRNA）参与花青素合成的转录后调控（Yang et al.，2019），但在萝卜中的研究目前尚属空白。

④解析外界因素影响花青素合成的作用机理。前人研究发现光照、糖、植物激素、胁迫、富氢水和氮素均可影响萝卜花青素的积累，但其作用机制仍不明确。此外，上述研究均集中于对萝卜芽苗菜或幼苗下胚轴花青素生物合成的影响，这些处理对萝卜肉质根花青素积累的调控和作用机制仍需进一步的研究。