沉默circ_0006104上调miR-370-3p抑制小鼠心脏成纤维细胞增殖、活化和胶原合成

李亚飞，杜颖强，王泽穆，张 俊*

(1.南京医科大学附属苏州医院 心内科，江苏 苏州 215000； 2.南京医科大学第一附属医院 心内科，江苏 南京 210000)

心脏重构被认为是心力衰竭的重要病理过程，而心肌损伤后心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts, CFs)的持续活化可加速心室重构发生[1]。因此，如何阻止CFs纤维化从而延缓或逆转心脏重构是当前研究的热点。环状RNAs(circularRNAs,circRNAs)是一类通过3′端与5′端的连接实现RNA环状化的新型非编码RNA，相比较lncRNA(long non-coding RNA)和miRNA(microRNA)，circRNAs具有结构稳定、保守性高及在人类基因组表达丰富等优势[2]。近年有研究显示大量circRNAs在心室重构过程表达失调并参与调控心肌纤维化这一病理过程[3]。Circ_0006104是利用RNA-seq芯片测序结果筛选获得，在活化的CFs中表达显著上调，且在哺乳动物中高度保守，而功能尚不清楚的circRNA。本研究旨在证实circ_0006104对CFs增殖，活化和胶原合成的影响，并探讨可能的机制，为心脏损伤后心室重构预防提供新思路及潜在治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：新生(1～3 d龄)C57BL/6乳鼠50只，体质量约1.5 g(南京医科大学动物实验中心)。

1.1.2 主要实验试剂：胎牛血清、马血清、DMEM液、青/链霉素双抗及含0.25% EDTA胰蛋白酶(Gibco公司)；血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)和胰蛋白酶粉末(Sigma-Aldrich公司)；Ⅱ型胶原酶(Worthington公司)；Circ_0006104敲低/过表达质粒以及miR-370 mimic/inhibitor(南京吉玛基因公司)；α-SMA和GAPDH一抗(Abcam公司)，二抗(CST公司)；免疫荧光染色EDU试剂盒(广州瑞博生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 CFs的培养与分组处理：用含10%胎牛血清的DMEM培养并传代CFs。取第2，3代CFs，待增殖至50%～60%汇合时，依据不同处理分为：对照组(small/short hairpin RNA control,shRNA Con)；Circ_0006104 敲低组(circ_0006104 shRNA)；Ang Ⅱ+shRNA对照组(Ang Ⅱ+shRNA Con)；Ang Ⅱ+ circ_0006104 敲低组 (Ang Ⅱ+ circ_0006104 shRNA)；Ang Ⅱ+ circ_0006104 敲低+miR-370抑制组 (Ang Ⅱ+ circ_0006104 shRNA+ miR-370 inhibitor)。参考Lipofectamine 3000使用说明对CFs进行转染操作。

1.2.2 Western blot检测 α-SMA的蛋白表达：将细胞裂解液加入不同处理组CFs中，充分裂解后用BCA法检测蛋白浓度。经过电泳分离、转膜、封闭、一抗(GAPDH、α-SMA)、TBST 漂洗、二抗后，进行曝光和统计分析。

1.2.3 RT-qPCR检测Col Ⅰ和Col Ⅲ的mRNA表达：将心肌组织或CFs加入Trizol中磨碎提取总RNA。测定浓度后反转录为cDNA, 反应条件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，然后置4 ℃保存备用。按照试剂盒说明进行定量实时PCR测定目的基因表达，反应条件如下：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。具体引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.4 EdU(5-ethynyl-2′-deoxyuridine)免疫荧光染色检测CFs增殖水平：根据EDU试剂盒操作说明，在CFs加入A液过夜，经甲醛固定、0.2% Triton破膜、山羊血清封闭、一抗和二抗孵育后，配制EDU染色溶液，加入培养板于室温避光慢摇孵育45 min。然后加入DAPI染色剂室温慢摇5 min，用蔡司显微镜拍摄CFs的增殖水平并进行统计。

1.2.5 双荧光素酶检测circR_0006104与miR-370-3p靶向关系：构建包含circR_0006104与miR-370-3p潜在结合序列的野生型重组质粒pGL3-circ_0006104(wt)，以及包含相应结合序列突变的pGL3-circ_0006104(mut)。将重组质粒+miR-370-3p mimic或重组质粒+ mimic NC共转染至HEK293细胞中，根据说明书检测荧光素酶活性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Circ_0006104的筛选和基本特征分析

利用高通量测序数据[4], 选择在激活的CFs中差异最明显20个circRNAs，依据保守性原则，筛选到circ_0002455，circ_0006104和circ_0003091(图1A)。运用RT-qPCR检测，发现circ_0006104在Ang Ⅱ处理的CFs中上调最为明显(图1B)。保守性分析显示circ_0006104在人和小鼠中具有高度保守(图1C)。RT-qPCR产物Sanger分析显示circ_0006104具有成环性(图1D)。FISH结果显示circ_0006104共定位于胞质和胞核(图1E)。

A.the 20 most significant dysregulated circRNAs; B.RT-qPCR was used to detect the expression of 3 circRNAs; C.conservative analysis; D.circular verification of circ_0006104;E.circ_0006104 intracellular localization verification, scale bar=20 μm; *P<0.05,**P<0.05 compared with control group

2.2 沉默circ_0006104对Ang Ⅱ诱导的CFs增殖的影响

构建circ_0006104敲低质粒，RT-qPCR验证其敲低效率(图2A)。与对照组比较，circ_0006104敲低组CFs增殖水平没有显著改变，而Ang Ⅱ处理组CFs增殖水平明显增加(P<0.05)，Ang Ⅱ+ circ_0006104 shRNA组的CFs增殖水平较Ang Ⅱ组明显降低(P<0.05)(图2B,C)。

A.validation of transfection efficiency; B,C.effect of circ_0006104 shRNA on CF proliferation; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with Ang Ⅱ group

2.3 沉默circ_0006104对Ang Ⅱ诱导的CFs活化和ECM合成的影响

与对照组相比，circ_0006104沉默组CFs中α-SMA的蛋白表达没有明显变化，而Ang Ⅱ组CFs的α-SMA表达明显升高(P<0.05)，另外，Ang Ⅱ+ circ_0006104 shRNA组中α-SMA表达较Ang Ⅱ组明显减少(P<0.05)(图3A,B)。与Ang Ⅱ组比较，Ang Ⅱ+ circ_0006104 shRNA组中ECM(extracel-lular matrix, ECM)合成相关基因Col Ⅰ和Col Ⅲ的表达明显降低(P<0.05)(图3C,D)。

A,B.effect of circ_0006104 on α-SMA expression; C,D.effect of circ_0006104 on Col Ⅰ and Col Ⅲ expression;*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with Ang Ⅱ group

2.4 Circ_0006104靶向结合miR-370-3p

Circ_0006104与miR-370-3p存在结合位点(图4A)。荧光素酶报告分析发现miR-370-3p mimic组细胞中转染circ_0006104野生型(wt)过表达载体的荧光素酶活性较mimic NC组显著下调(P<0.05)(图4B)。RT-qPCR结果显示,与对照组比较，circ_0006104过表达组miR-370-3p表达明显下调，而circ_0006104 shRNA组miR-370-3p表达明显上调(图4C)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with shRNA control group

2.5 抑制miR-370-3p逆转沉默circ_0006104对CFs增殖的阻碍作用

构建miR-370-3p抑制剂并验证其转染效率(图5A)。与Ang Ⅱ+ circ_0006104 shRNA组相比较，Ang Ⅱ+ circ_0006104 shRNA+miR-370-3p inhibitor组的增殖水平明显升高(图5B,C)。

A.validation of transfection efficiency; B,C.effect of circ_0006104 shRNA and miR-370 inhibitor on CF proliferation;*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with circ_0006104 shRNA group

2.6 抑制miR-370-3p逆转circ_0006104敲低对CFs活化和ECM合成的阻碍作用

与Ang Ⅱ+ circ_0006104 shRNA组相比较，Ang Ⅱ+ circ_0006104 shRNA+miR-370-3p inhibitor组α-SMA表达显著升高(P<0.05)(图6A,B)。Ang Ⅱ+ circ_0006104 shRNA+miR-370-3p inhibitor组Col Ⅰ和Col Ⅲ的mRNA表达较Ang Ⅱ+ circ_0006104 shRNA组明显增加(P<0.05)(图6C,D)。

A,B.effect of miR-370-3p on α-SMA protein expression; C,D.effect of miR-370-3p on Col Ⅰ and Col Ⅲ mRNA expression; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with circ_0006104 shRNA group

3 讨论

随着RNA测序技术的深入应用，大量circRNAs在不同物种、不同发育阶段和不同病理条件下被发现[5]。近年研究表明circRNAs异常表达对心脏CFs活化、增殖和ECM合成具有重要调控作用[6]。本研究发现circ_0006104表达在Ang Ⅱ诱导的体内外模型中显著上调，提示circ_0006104可能介导CFs激活后相关纤维化表型。功能缺失实验表明沉默circ_0006104明显抑制了Ang Ⅱ诱导的CFs增殖、活化和ECM合成。

心脏遭受损伤刺激后可导致细胞和神经体液环境的改变，从而触发CFs的激活和增殖增加，被激活的CFs可转变为肌成纤维细胞，该过程扰乱了基质金属蛋白酶的平衡并促进ECM合成[7]。ECM水平的增加还可改变心肌细胞生存的内外环境，从而触发了与心肌肥大和机械功能障碍相关的基因程序的激活[8]。EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物, 能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶渗入正在复制的DNA分子,可精确检测细胞的增殖情况[9]。另外，α-SMA，代表成纤维细胞活化为心肌性成纤维细胞的标记基因，在纤维化心肌中表达显著上调[10]。Col Ⅰ和Col Ⅲ是ECM合成相关标志物，其表达水平与纤维化程度显著相关[11]。本研究结果显示沉默circ_0006104可以显著降低Ang Ⅱ诱导的EDU+细胞比例，α-SMA、Col Ⅰ和Col Ⅲ表达，提示敲低circ_0006104可阻碍Ang Ⅱ诱导心肌纤维化进展。

运用生物学信息学分析，本研究筛选获得circ_0006104靶结合基因miR-370-3p，并利用实验证明circ_0006104能够结合并负向调控miR-370-3p。miR-370 在心肌纤维化过程已被证明具有重要调控作用[12]。通过挽救实验，证实miR-370-3p介导了circ_0006104沉默对CFs增殖、活化和ECM合成的阻碍作用。本研究初步揭示了circ_0006104在CFs活化和增殖迁移过程中作用和潜在的分子机制，不足之处是尚待在体内进一步证实circ_0006104对心室重构的作用。

综上所述，沉默circ_0006104可以通过靶向调控miR-370-3p抑制Ang Ⅱ诱导的CFs增殖、活化和ECM合成。本研究为预防心脏重构和心力衰竭的治疗提供了新的视野和潜在的治疗靶点。