地塞米松对胶原诱导性关节炎大鼠模型软骨退化的改善作用

许冰馨,范凯健,2,王婷玉,陈慧瑾

(1.上海交通大学医学院附属第九人民医院药剂科,上海 200011;2.上海市崇明区精神卫生中心药剂科,上海 202150)

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的致病因素尚不明确，可能与遗传、免疫、环境有关［1］。RA的主要特征是滑膜炎和软骨破坏。软骨组织由基质、纤维、软骨细胞构成，兼具硬度和弹性，在承重和防止骨骼磨损中发挥着重要作用。由于软骨中不含血管和神经，一旦受损，后期修复能力较差［2］。现阶段，临床上用于软骨保护的药物有生物制剂、抗风湿药物、软骨营养补充剂等［3-4］。这些营养补充剂含有如氨基葡萄糖、硫酸软骨素等物质，可以对关节软骨起到营养、润滑作用。中医的热敷、针灸等理疗方式也可以促进血液循环，从而改善软骨修复。由于目前骨保护药物和中医理疗对软骨的作用仍存在局限性，因此抑制软骨损伤机制的研究及相关药物的开发对控制疾病发展具有重要意义。

地塞米松（dexamethasone，DEX）是一类长效且强效的糖皮质激素，具有抗炎和解热镇痛作用。临床上常结合抗风湿药、生物制剂等用于治疗RA。Yu等［5］研究发现，局部注射DEX可以显著缓解关节肿痛。Formica等［6］研究发现，将DEX与Ⅱ型胶原亲和性复合物或壳聚糖结合，可提高DEX在软骨中的渗透性，延长其保留时间，从而抑制炎症标志物表达，并提高糖胺聚糖水平。临床上小剂量DEX注射关节腔用于治疗RA是安全有效的。有研究发现，关节内注射糖皮质激素可以减少药物引起的全身性不良反应［7］。虽然中低剂量的激素常被作为RA的维持治疗药物，但大剂量长期使用激素也会造成严重不良反应。因此，选择给予适当剂量的DEX治疗可以起到保护软骨和延缓疾病进展的作用。本课题组前期通过腹腔注射1 mg/kg DEX制剂，研究DEX对胶原诱导性关节炎（collageninduced arthritis，CIA）疼痛和炎症的作用机制［8-9］。在此基础上，本研究继续验证腹腔注射1 mg/kg DEX对软骨的影响，并探讨其保护软骨的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性Wistar大鼠30只，6周龄，体质量为（160±20）g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司［SCXK（沪）2018-0016］。饲养于上海交通大学医学院附属第九人民医院实验动物中心［SYXK（沪）2020-0025］，环境温度（22±2）℃，相对湿度50%～60%，光照为12 h昼夜各半。实验经本院实验动物伦理委员会审核批准（HKDL［2015］16）。

1.2 试剂

牛Ⅱ型胶原和弗氏不完全佐剂（美国Chondrex公司）、DEX（加拿大Stemcell公司）、TRIzol（美国Ambion公司）、PCR引物（上海生工生物科技有限公司）、SYBR Green qPCR预混液（日本TaKaRa公司）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和解聚蛋白样金属蛋白酶（a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADMATS）的一抗（美国Cell Signaling Technology公司）、4%多聚甲醛溶液、乙二胺四乙酸（EDTA）、阿尔新蓝染色液（武汉谷歌生物科技有限公司）、戊巴比妥钠（美国Sigma公司）。

1.3 仪器

荧光定量PCR仪（美国Thermo Scientific公司），ProFlex PCR热循环仪（美国Thermo Fisher公司）；Microfuge 20R离心机（德国Beckman公司）、显微镜（日本Olympus公司）。

1.4 实验分组及CIA造模方法

30只大鼠适应性喂养1周后，随机均分成正常组、模型组和DEX组，每组10只。4℃冰浴条件下，将牛Ⅱ型胶原与弗氏不完全佐剂1:1充分混匀形成白色乳剂。将实验当天即第一次免疫造模时间定义为第0天，将0.1 mL白色乳剂注射于模型组和给药组大鼠尾根部皮内，正常组大鼠尾根部皮内仅注射0.1 mL生理盐水（即0.9%NaCl溶液）。在第一次免疫后的第7天，再次制备相同乳剂，采用相同方法对模型组和DEX组进行加强免疫，正常组大鼠尾根部皮内仅注射0.1 mL生理盐水，此时即完成造模［10-11］。

1.5 给药方式与剂量

给药组大鼠在加强造模免疫后第1天（即第一次免疫造模后第8天）开始给予DEX腹腔注射，剂量为1 mg/kg［12］。给药频次为隔日给药，连续4周。其余动物给予等体积的生理盐水腹腔注射。

1.6 取材

给药完成后，采用戊巴比妥钠（45 mg/kg）对大鼠进行腹腔注射麻醉，待彻底麻醉后经腹主动脉取血，处死大鼠。然后沿股骨头分离大鼠后肢，用显微剪刀轻轻将股骨头上半透明状的软骨剥离，保存于-80℃，用于实时定量PCR检测。剥离大鼠后肢上多余的肌肉组织并暴露出膝关节，将膝关节浸没在多聚甲醛溶液中固定过夜，用于后期制备石蜡切片，以及分别进行阿尔新蓝染色和免疫组织化学实验。

1.7 膝关节脱钙并制作石蜡切片

将大鼠膝关节浸没在EDTA脱钙液中，隔日更换一次脱钙液。4℃摇床上脱钙30 d以上。采用针刺法检测脱钙程度，即注射器针头可无障碍穿透骨头才表示脱钙成功。脱钙后的样本，经脱水、软石蜡34 h、硬石蜡0.5 h的浸蜡后，置于熔融态的石蜡包埋框中完成石蜡包埋，冷却凝固后制作成4 μm厚的膝关节矢状面石蜡切片。

1.8 阿尔新蓝染色

大鼠膝关节病理切片经过脱蜡后，进行阿尔新蓝染色、漂洗、脱水、中性树胶封固。显微镜下观察膝关节软骨破坏情况，运用Image J 1.8.0软件计算各组大鼠膝关节的软骨面积、厚度、软骨细胞数，并分析膝关节损坏严重程度。

1.9 实时定量PCR检测软骨中蛋白酶转录水平

实验前取出保存于-80℃的软骨，置于研钵中，倒入液氮并将其研碎。TRIzol法提取总RNA，在PCR仪上转成cDNA。实时定量PCR法检测各组软骨组织中MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5的mRNA表达水平。实时定量PCR程序如下：95℃变性、退火至60℃，经过40个循环后，65℃延伸5 s。引物序列见表1。

表1 实时定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time quantitative PCR

1.10 免疫组织化学

将用于免疫组织化学检测的大鼠膝关节切片经脱蜡水化后，首先进行抗原修复，过氧化氢阻断过氧化物酶，血清封闭，然后进行一抗孵育、二抗孵育，DAB显色。苏木精对比染色细胞核、冲洗、干燥、封固后，显微镜下观察。

1.11 统计学分析

采用统计学分析软件SPSS 22.0进行结果分析，数据采用平均数±标准误（-x±s-x）表示。组间数据差异采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DEX对大鼠膝关节软骨病理的影响

阿尔新蓝染色结果如图1所示。与正常组相比，CIA大鼠膝关节中软骨厚度和面积减少（P＜0.001），软骨细胞数量（P＜0.001）和表面光滑度下降，软骨侵蚀严重。

图1 地塞米松对胶原诱导性关节炎大鼠膝关节软骨退化的抑制作用Figure 1 Inhibitory effect of dexamethasone on degeneration of knee articular cartilage in collagen-induced arthritis rats

经过DEX治疗后，软骨面积、厚度和细胞数量下降程度得到明显抑制，与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；而且软骨表面较光滑，软骨侵蚀程度也得到明显改善。结果说明DEX治疗可以一定程度上抑制CIA大鼠膝关节软骨破坏。

2.2 DEX对软骨中基质蛋白酶mRNA表达的影响

实时定量PCR结果（图2）显示，CIA大鼠软骨中MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5mRNA的表达水平明显较正常组升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；而DEX治疗后，这些基质蛋白酶的表达量均较模型组出现不同程度的下降，差异有统计学意义（P＜0.001）。结果表明DEX治疗可以减少CIA软骨组织中这些基质蛋白酶的mRNA表达。

图2 实时定量PCR检测地塞米松对胶原诱导性关节炎大鼠膝关节软骨组织中基质蛋白酶mRNA转录的抑制作用Figure 2 Inhibitory effect of dexamethasone on matrix metalloproteinases transcription in the knee cartilage tissue of collagen-induced arthritis rats detected by real-time quantitative PCR

2.3 DEX对软骨中相关酶ADAMTS-5、MMP-9、MMP-13蛋白表达的影响

前期研究显示，相较于正常组大鼠，CIA大鼠软骨中MMP-9、MMP-13和ADAMTS-5的含量明显升高［13］。因此，本研究侧重检测这3种蛋白在模型组和DEX组的表达变化。免疫组织化学检测结果（图3）显示，模型组大鼠膝关节软骨中MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5表达较明显；给药后DEX组中MMP-9、MMP-13和ADAMTS-5水平较CIA模型大鼠明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 免疫组织化学法检测地塞米松对胶原诱导性关节炎大鼠膝关节软骨中MMP-9、MMP-13和ADAMTS-5蛋白表达的抑制作用Figure 3 Inhibitory effect of dexamethasone on MMP-9,MMP-13 and ADAMTS-5 expression in the knee cartilage of collagen-induced arthritis rats detected by immunohistochemistry

3 讨论

软骨和骨破坏的现象常见于类风湿关节炎，但软骨破坏的进程是不可逆的，所以防止软骨损伤对于RA患者关节功能的保护具有重要意义。关节软骨属于纤维软骨，质地较坚韧，具有吸收运动产生的震动、减少摩擦和维持关节稳定性的作用。它由软骨细胞、细胞间质组成。而细胞间质则是由骨胶原纤维、蛋白多糖和水组成。细胞间质的降解造成了软骨损伤。现有研究证明，MMPs和ADAMTS在RA患者血液和滑膜中大量存在，有助于软骨的分解代谢，在软骨损伤修复中具有重要作用［14］。

MMPs是蛋白水解酶的主要成员，其活性位点需要锌离子才能发挥作用。MMPs对于维持组织结构的稳定性至关重要。它在pH中性环境下具有活性，可以催化细胞外基质（extracellular matrix，ECM）大分子（如间质和基底膜胶原蛋白）、蛋白聚糖（如聚集蛋白聚糖和纤维调节蛋白）以及辅助ECM蛋白（如纤连蛋白）降解。大多数MMPs都是以无活性的酶原形式存在，但其在病理状态下会被激活，与之对应的金属蛋白酶组 织 抑 制 剂（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP）可调节其活性［15］。MMPs水平在RA患者的软骨中显著升高，且内源性TIMP的减少可促进软骨基质合成代谢紊乱，破坏ECM蛋白，并直接促进软骨细胞凋亡和血管再生。多项研究发现，MMP-9和MMP-13可以导致软骨基质损伤［16］。MMP-9在RA中表达量增加，并能降解关节的非胶原基质成分。而MMP-13除胶原蛋白外，还降解蛋白聚糖分子和聚集蛋白聚糖，在基质破坏中具有双重作用［17］。Zhang等［18］研究发现，MMPs的下调有利于小鼠半月板损伤的改善，并提升关节软骨的修复能力。

ADAMTS也可以水解软骨基质中的蛋白多糖，破坏软骨细胞，并阻止软骨内骨形成，而抑制其活性对于缓解软骨退行性病变和促进软骨修复是有利的［16］。ADAMTS-4和ADAMTS-5已被证明在骨关节炎中起重要作用。它们可通过降解聚集蛋白聚糖和软骨寡聚基质蛋白来减少软骨细胞和细胞外基质，从而诱发关节炎［19］。目前，ADAMTS已被广泛作为缓解骨性关节炎药物研发的靶标，ADAMTS抑制剂和其单克隆抗体也正在积极开发中［20］。

关节中MMPs和ADAMTS的正常表达有助于维持骨稳态。然而，在RA中，促炎细胞因子的刺激会导致MMPs和ADAMTS的表达显著增加。CIA与RA类似，同样存在滑膜侵害和软骨损伤［21］。DEX作为糖皮质激素，抗炎、抗风湿作用强大。本课题组之前的研究已发现，DEX对CIA大鼠滑膜炎症和疼痛有明显的抑制作用，且治疗效果明显［8，22］。DEX可以通过减少滑膜中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17等炎症因子和血清中促炎因子IL-17a，并增加抗炎因子TGF-β1，进而减轻滑膜炎症。DEX通过抑制大鼠背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）中疼痛相关因子NPY、NGF、BDNF和TRPV1以及炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17的表达，抑制大鼠足部关节疼痛。DEX通过抑制CIA大鼠脾脏T淋巴细胞中促炎因子的形成，同时调节大鼠外周血中Th1/Th2和Th17/Treg比值，对CIA大鼠具有整体免疫调节作用。上述实验结果提示，DEX治疗CIA的机制是减轻滑膜炎症、抑制疼痛相关致痛因子和炎症因子表达，并调节了整体免疫失衡［8-9］。

本实验主要研究DEX对CIA大鼠软骨退化的抑制作用并探讨其机制。阿尔新蓝染色实验中发现，CIA大鼠会产生软骨损伤，模型组大鼠的软骨厚度、面积、表面光滑度以及软骨细胞数都较正常组大鼠出现明显降低，而经过DEX注射治疗后软骨损伤明显减轻。有研究证明，MMPs和ADAMTS在软骨损伤修复中具有重要作用［14］。本研究中，腹腔注射DEX（1 mg/kg）治疗后CIA大鼠软骨中MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5的mRNA表达水平均降低，软骨厚度、面积和细胞数均较模型组大鼠增加。免疫组织化学实验也进一步发现，给药组大鼠软骨中MMP-9、MMP-13和ADAMTS-5表达量均较模型组明显减少，这与mRNA表达检测结果相一致。因此，推测DEX可能是通过抑制CIA大鼠软骨中MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5表达，阻遏软骨细胞和软骨面积减少，进而减轻软骨的损伤。

综上所述，DEX（1 mg/kg，每周3次，连续4周）腹腔注射治疗可以通过抑制CIA大鼠软骨中MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达起到直接抑制关节软骨损伤的作用。本实验尚存在不足之处，例如DEX是经典的糖皮质激素，临床上常与药物联合使用来治疗各类免疫紊乱的疾病，而多次的腹腔注射在临床上容易降低患者依从性。因此，本课题组正在研究DEX的温敏凝胶缓释制剂经膝关节局部注射的用药效果，探索该新型缓释制剂在膝关节内释放给药的疗效，而本实验结果可以提供对照和用药剂量的参考依据。

[医学伦理声明Medical Ethics Statement]

本研究涉及的所有动物实验均已通过上海交通大学医学院附属第九人民医院实验动物伦理委员会批准（编号为HKDL[2015]16）。所有实验过程均遵照中国实验动物相关法律法规条例要求进行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Experimental Animal Ethics Committee of Shanghai Ninth People’s Hospital(IACUC No.HKDL[2015]16).All experimental procedures were performed in accordance with the requirements of laws and regulations in China related to experimental animals,includingAnimal Management Regulations(01/03/2017),Laboratory Animal:Guideline for Ethical Review of Animal Welfare(GB/T 35892-2018),and so on.

[作者贡献Author Contribution]

许冰馨负责实验操作和文章写作；范凯健参与文章修改及实验指导；王婷玉负责课题制定和实验设计；陈慧瑾参与实验设计和文章修改。

[利益声明Declaration of Interest]

所有作者均声明本文不存在利益冲突。