水蕨愈伤胚胎发生的代谢组学研究

李贵生

(吉首大学 生物资源与环境科学学院，湖南吉首 416000)

胚胎发生是植物繁殖的重要方式，除此之外是压条、扦插和嫁接。植物的胚胎发生既可通过合子、也可通过体细胞进行。很多种类的体细胞都能进行胚胎发生，譬如单倍体的小孢子和二倍体的茎尖。体细胞可以直接形成胚胎，也可在此之前先形成愈伤。一般来讲，体细胞胚胎发生的原胚期会先后经历细胞重编程、细胞获得全能性以及胚性细胞形成[1-2]。体细胞胚胎随后依次变成球状胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚等，这与双子叶植物合子的胚胎发生极为相似，除了没有最后的失水以及休眠[3]。愈伤的胚胎发生是了解体细胞胚胎发生以及合子胚胎发生的重要工具。

104个代谢物的靶向研究表明，咖啡(Coffeaarabica)的愈伤在增殖期较分化期有更多的葡萄糖、果糖、甘氨酸、蛋氨酸以及甘油，而后者有更多的蔗糖、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸、咖啡酸、苯甲酸、鸟苷、肌苷以及黄苷[4]。用核磁共振分析香荚兰(Vanillaplanifolia)愈伤中的12个化合物发现，其增殖期相比于分化期有更多的蔗糖、葡萄糖和丙氨酸，而后者有更多的γ-氨基丁酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、缬氨酸以及次级代谢物(如酚类化合物)[5]。LC-MS的非靶向代谢组研究在棉花(Gossypiumhirsutum)的愈伤胚胎发生中发现了581个代谢物，且其分化期相比于增殖期有更多的天冬氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸以及维生素B1[6]。质谱分析在水飞蓟(Silybummarianum)愈伤中鉴定了19个代谢物，而其增殖期有更多的谷氨酰胺、异亮氨酸、精氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、色氨酸、蔗糖、肉桂酸、莰非醇、槲皮苷、亚麻酸、杨梅苷、莽草酸-3-磷酸等，分化期则有更多的尿素、葡萄糖以及果糖[7]。裸子植物的愈伤形成体细胞胚胎的过程中，赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸会显著增加，而蔗糖显著减少[8]。此外，凹唇姜(Boesenbergiarotunda)的胚性愈伤相比于非胚性愈伤含有更多的谷氨酸、精氨酸和赖氨酸，但几乎不含乔松素、球松素、小豆蔻素以及山姜素[9]。甘蔗的胚性和非胚性愈伤相比有更多的糖和氨基酸[10]。苯丙醇以及多酚类如羟基肉桂酸对于愈伤的诱导非常重要[11]，而多胺、肉桂酸、莰非醇、五羟黄酮、杨梅黄酮、亚麻酸在体细胞胚的形成中有重要作用[7,12]。相比于外植体和再生植株，愈伤组织有更多的能量代谢和细胞分裂方面的代谢物如糖和氨基酸，但是含有较少的木质化代谢物如咖啡酸酯和胆碱，以及免疫性相关的代谢物如甲基哌啶和3-甲基-2-酮哌嗪[13]。

蕨类植物是种子植物的姊妹类群，对于陆地植物胚胎发生的认识具有不可替代的作用。树蕨(Cyatheadelgadii)的直接体细胞胚胎发生能被分为3个阶段，即线状原胚期、胚胎的一叶期以及二叶期[14]，并且有相关蛋白的伴随[15]。水蕨(Ceratopterisrichardii)是蕨类植物研究的准模式物种，而它的体细胞胚胎可从茎尖诱导，即先在6-苄氨基嘌呤(6BA)的培养基中形成愈伤，然后在没有添加任何外源激素的情况下分化、直至最后形成再生植株[16-17]。水蕨的体细胞胚胎发生可能与BABYBOOM(BBM)之类的基因有关[18]。本研究通过非靶向代谢组学分析，比较水蕨愈伤的增殖期和分化期代谢物的差异，为进一步了解植物胚胎发生提供了资料。

1 材料和方法

1.1 愈伤组织培养

水蕨(Langdale JA赠)孢子用1∶5倍稀释的次氯酸钠消毒，然后用无菌水洗5遍[16-17]。水蕨孢子于盛有20 mL 1× MS液体培养基的培养皿(直径 9 cm)中，置于光照培养箱(25 ℃，16 h光照)。经萌发、受精、胚胎发育，约4周后，将已有根和茎的孢子体置于含5 μmol/L 6BA的1× MS固体培养基上。约2周后，从孢子体茎尖清理出愈伤组织、并将之分小，然后继代培养。制备材料时，将同一部分愈伤组织分为2份，而1份放于含6BA的培养基，另1份放于只有MS的培养基，培养4 d后收集。前一种材料命名为6BA，而后一种材料命名为MS，它们各有6份作为生物学重复。

1.2 非靶向代谢组学测定

材料用液氮速冻并保存于-70 ℃，然后用干冰运往华大基因(深圳，中国)。取150 mg材料，加入1 mL预冷的甲醇和水的混合液，用组织研磨器在50 Hz、4 ℃研磨5 min，并每10 min涡旋1次、共3次，4 ℃放置过夜[19]。再次涡旋，然后离心(13 000 g，10 min，4 ℃)。取800 μL上清液，将之过滤备用(0.22 μm)。用ACQUITY UPLC I-Class(Waters，美国)以及QTRAP6500 Plus(SCIEX，美国)进行LC-MS分析，色谱柱是ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100 mm，1.8 μm)(Waters)。流动相A液是0.1%甲酸水溶液，而B液是0.1%甲酸乙腈溶液。40 ℃梯度洗脱，依次是0～2 min，5% B；2～22 min，5%～95% B；22～27 min，95% B；27～30 min，5% B，溶液流速是0.3 mL/min。离子源参数是500 ℃、4 500 V，GS1、GS2和CUR分别是10、40和20 psi。在MRM模式下设置代谢物的母子离子对信息、碰撞能量、去簇电压以及保留时间。上样顺序是QC(标准品)-1、QC-2、MS.1、MS.2、MS.3、MS.4、MS.5、QC-3、MS.6、6BA.1、6BA.2、6BA.3、6BA.4、6BA.5、6BA.6、QC-4和QC-5。

1.3 数据分析

在HRAM-PMDB(华大基因)和mzCloud(https://www.mzcloud.org/)数据库鉴定代谢物，用MultiQuant软件(SCIEX)计算代谢物色谱质谱图峰面积(此即代谢物的相对含量)。运用偏最小二乘回归建立代谢物表达量和样品类别之间的关系模型，通过计算变量投影重要度即VIP来衡量各代谢物表达模式对各组样本分类的影响强度和解释能力(一般认为VIP大于1才表示该代谢物对样本类别的区分有显著作用)。峰面积数据先进行log2转换，再进行Pareto缩比，然后用于建立偏最小二乘法-判别分析即PLS-DA的模型[20]。建立模型时进行7折交互验证(7 fold cross validation)，并进行200次响应排序检验。差异积累代谢物的标准是VIP≥1，变化倍数≥1.2或者≤0.83，以及P< 0.05(单尾不成对等方差t检验)。通过人类代谢组学数据库即HMDB和京都基因与基因组百科全书即KEGG对代谢物进行功能注释。差异积累代谢物聚类分析时先将峰面积数据进行log2转换以及z-score标准化，然后采用欧氏距离进行层次聚类。

2 结果与分析

2.1 水蕨愈伤胚胎发生过程

在6BA培养基上的愈伤会一直处于增殖状态，而其颜色保持为祖母绿(图1，A)。愈伤转到没有任何激素添加的MS培养基后，开始分化。分化早期(第4天)没有明显的颜色改变(图1，B)，但随着分化的推进愈伤开始变绿(图1，C)。一直分化到第12天，愈伤都没有形态上的明显变化(图1，D)。但是，最终(第24天)愈伤会再生出茎叶(图1，E)，而根会在更晚的时候出现。因此，处于以上两个不同生长环境的愈伤可分别代表水蕨愈伤的增殖期样本和分化期样本，而侧重分化早期能避开叠加的形态差异、从而捕捉到触发分化的分子机制。

A. 增殖期；B. 分化4 d；C. 分化8 d；D. 分化12 d；E. 分化24 d；标尺=1 mm

2.2 水蕨愈伤代谢物的种类

通过仪器检测以及数据库比对，发现MS样本里有402个代谢物。在6BA样本里有同样多的代谢物，也就是说没有样本特异性代谢物。其中257个代谢物能被KEGG系统分类，它们分属于生物作用化合物、植物化学化合物、类脂、以及其他物质(表1)。生物作用化合物中，苯及其衍生物、氨基酸/肽及其类似物、有机酸等占了约48.9%，而其他种类的物质最多8种、最少1种。植物化学化合物中，黄酮最多，萜类次之，而其他类最多含有6种物质。类脂中聚酮最多、脂肪酰次之、而固醇脂只有一种。其他物质中，各个种类均只有1～2种化合物。

有多种氨基酸，但没有赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸或其类似物。有3种激素即赤霉素、脱落酸、茉莉酸，但没有生长素和6BA。有4种核苷酸或其类似物。相当一部分为药物成分，如6种喜树碱衍生物、依托泊苷、达卡巴嗪、拓扑替康、蟾毒灵、古伦宾、盐酸阿霉素、放线菌酮、乌苯美司、鬼臼毒素可以用于抗肿瘤，厄贝沙坦、醋丁洛尔、地奥司明可以用于降血压，另外还有帕金森病药物苯海索、抑郁症药舍曲林、抗过敏药物倍他米松和三七素。

2.3 水蕨愈伤代谢物的含量

几乎所有402个代谢物在MS和6BA两类样本中的含量大致相同(图2)。93.03%代谢物的含量水平大约集中在14～23之间，而其中含量水平约为17的代谢物最多、占比19.65%。含量水平低的前5个代谢物依次是麦黄酮、表没食子儿茶素、银杏内酯C、十五酸以及维采宁Ⅱ，而含量水平高的前5个依次是梣酮、对羟基肉桂酸、对香豆酸、香豆素以及蟾毒灵；它们的差异倍数多达220。7种没食子衍生物、6种喜树碱衍生物中含量最高均可达19。赤霉素和茉莉酸的含量均约为18，而脱落酸的含量可达24。腺嘌呤、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、胞嘧啶、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、胸苷、尿苷、乳糖等的含量依次降低，但都大于17。

2.4 统计分析

MS组内的斯皮尔曼相关系数平均为(0.96±0.03)，6BA组内也为(0.96±0.03)，而组间为(0.95±0.03)，可以看出组内相关性高于组间相关性。PLS-DA预测到3个主成分，前2个主成分的比例分别是31.12%和19.52%(图3，A)。所用模型的适合度R2为1，预测力Q2为0.52，而模型检验表明R2的截距为0.92、Q2的截距为-0.89(图3，B)。PLS-DA检测到VIP≥1的代谢物有119个。t检验表明，其中只有45个代谢物为P< 0.05，而又有3个代谢物的变化倍数小于1.2。代表性代谢物的分析表明，皂皮酸和盐酸拓扑替康确是差异显著、但变化倍数太小，而棉籽糖和异土木香内酯满足以上3个标准，白头翁皂苷A和四氢小檗碱则不满足任何一个标准(图3，C)。所以，水蕨愈伤分化确实导致了代谢物的差异性积累。

2.5 水蕨愈伤代谢物的差异性积累

42个代谢物在2个样本间有差异性积累，变化倍数大约在1.2～2.0之间。聚类分析中一个6BA样品与MS样品的距离较近、但并不混杂其中，这与两类样品的取材时间间隔较小相一致(图4)。在MS样本里有23个代谢物含量较高，其中前3个分别是桑黄素、哈尔碱盐酸盐以及鼠尾草酚，后3个分别是3-(3-甲氧基苯基)丙酸、美迪紫檀苷以及异土木香内酯(图4)。在6BA样本里有19个代谢物含量较高，其中前3个是N-乙酰-DL-色氨酸、麦角甾醇以及4′-去甲基鬼臼毒素，后3个则是棉籽糖、羟异栀子苷以及L-亮氨酸。MS中含量较高的代谢物大致可以分为3簇，而6BA中含量较高的代谢物大致可以分为2簇。不过，这些簇别并不对应于某类特殊结构或者功能的代谢物。例如，棉籽糖、三七素、羟异栀子苷、4′-去甲基鬼臼毒素、紫菫定酚等构成了A1簇，但它们分别是碳水化合物、氨基酸类似物、萜类、木质素以及生物碱。一些药物用途的代谢物显示了差异积累，如A3簇的甘松新酮可抗抑郁，B1簇的高藜芦酸和A2簇的醋丁洛尔可用于心血管疾病治疗。氨基酸中只有亮氨酸显示了差异性积累，其在6BA样本中含量较高，并与野百合碱同属A0簇。

红-黑-绿颜色梯度表示相对含量；不同颜色的条带表示代谢物分簇

富集分析表明，差异积累代谢物与两条代谢途径有关。其中，黄酮合成途径的P值是0.0028，涉及到的代谢物是山奈酚和橙皮素，而它们都在分化期有更高含量。ABC通道蛋白(ATP-binding cassette transporters)途径的P值是0.0080，涉及到的代谢物是棉籽糖和L-亮氨酸，而它们都在增殖期积累。

3 讨 论

3.1 水蕨愈伤代谢物的种类和含量

我们在水蕨的愈伤中发现了数百个代谢物，但是更好的检测仪器、更大的搜索数据库、以及分析更多的发育时期或者生理状态一定会鉴定出其他的代谢物。并且，随着功能注释的完善，也一定会发现水蕨愈伤具有更多作用明确的代谢物。另外，水蕨的愈伤因含有多种可治疗疾病的代谢物而引人注目。增殖期的愈伤与分化期的愈伤有着同样种类的代谢物，这暗示二者间的转变是一个量变而非质变。正如我们后面看到的确实有些代谢物在数量上发生了显著变化。尽管几乎用了同样的仪器、并且也测到了其他激素，却没有在水蕨的增殖或者分化的愈伤中发现生长素和激动素。这种情况在凹唇姜中几乎相反[9]，可能的原因是水蕨的愈伤要消耗大量的生长素和激动素、以致于它们在组织中的浓度低到难以检测。水蕨的愈伤组织里有多种已作为药物的代谢物，而它们之中仅有一种喜树碱也存在于棉花的愈伤中[6]。所以，植物愈伤胚胎发生的代谢组可能具有物种特异性。

多数代谢物在水蕨愈伤的增殖期和分化期具有相似的含量，所以它们与水蕨愈伤的这种转变无关，而个别差异积累的代谢物可能对此负责。各代谢物含量的变化倍数可多达220；与此类似，类别、结构、或者功能相似的代谢物并不具有大致相同的含量。水蕨愈伤不同于棉花愈伤，因为后者中酪氨酸的含量高于亮氨酸和谷氨酸[6]。

3.2 水蕨愈伤差异积累代谢物

水蕨愈伤从增殖期到分化期的转变伴随着较多代谢物的上调以及较少代谢物的下调，这一点与棉花相同[6]，这表明愈伤胚胎发生是一个日益复杂的过程。棉花的研究中差异积累的代谢物的比例大约是23.92%，并且差异倍数均在2倍以上[6]。相比而言，本研究的差异性积累代谢物的比例大约为10.44%，并且差异倍数均不超过2倍，这可能与我们的两类样本分歧时间较短有关。差异积累代谢物特别是其中的一些药物如何影响水蕨愈伤从增殖到分化的转变尚不得而知。黄酮合成途径被预测在该转变中发生了变化，因而可能对水蕨愈伤的胚胎发生不可缺少[6,21]。ABC通道蛋白是一个遍布于原核和真核生物的大家族，它们利用ATP水解的能量去主动转运离子、糖、脂类、肽和药物[22]。在植物中，ABC通道蛋白的突出功能是排出毒物和运输生长素[23]。ABC通道蛋白途径在水蕨愈伤组织增殖期活性突出，这与咖啡中愈伤相对于外植体有更多的ABC通道蛋白一致[24]，从而表明愈伤增殖期有独特的生长素极性运输机制[25]。