纳米银胁迫对甘西鼠尾草毛状根生长及丹参酮积累的影响

李铂，魏思敏，于金高，高璐，武宜，宋忠兴

（1.陕西中医药大学陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心，陕西 咸阳 712083；2.国家中药材产业技术体系咸阳综合试验站，陕西 咸阳 712083；3.咸阳市中药产业技术研究院，陕西 咸阳 712083）

甘西鼠尾草（Salvia przewalskii）又名甘肃丹参、紫丹参、红秦艽［1］，根中富含脂溶性丹参酮类活性成分，功效与丹参（S.miltiorrhiza）相近，多作为民族药和地方品种在四川、甘肃、云南等地替代丹参使用［2］。丹参酮是一类普遍存在于鼠尾草属（Salvia）植物中的以类异戊二烯为基本骨架的二萜醌类化合物，具有抗氧化、治疗心血管疾病、抑制肿瘤细胞发生等生理作用［3］。研究发现，丹参酮生物合成过程受多种外源金属离子的双向调控，如铜［4］、锌、锰［5］、镉［6］、银［7］等；编码丹参酮生物合成关键酶的某些基因，如3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR）、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）、柯巴基焦磷酸合成酶（Copalyl diphosphate synthase，CPS）等，通过响应外源物质的诱导，基因表达水平升高，最终导致丹参酮类成分的高效积累。

纳米银颗粒（Silver nanoparticles，AgNPs）具有高比表面积、粒径微小、量子效应显著等特点，广泛应用于医疗、化妆品、食品、纺织品、药物载体、水质净化等领域［8］。大多数AgNPs最终会进入土壤生态系统，进而被植物根系吸收，在生长水平、亚细胞水平和分子水平等多个维度与植物个体产生相互作用［9］。研究发现，AgNPs对植物生长的影响由AgNPs浓度、粒径大小、植物种类和作用时间等决定［10］；Ag-NPs暴露可诱导植物生成活性氧（ROS），进而对机体产生氧化胁迫［11］；AgNPs亦可能通过参与调节生长素、乙烯等植物激素的应答进一步影响植物的生长发育［12］。基于AgNPs的诸多理化特征和生物学效应，学者利用不同类型AgNPs处理黑麦草［13］、黄芪［14］、丹参［15］等植物，从植物生长特性、种子萌发规律、药效成分生物合成等方面开展了相关研究，然而AgNPs调控药用植物生长发育与次生代谢的生物学机制有待进一步深入探讨。

甘西鼠尾草是中药丹参的近缘种，丹参酮类成分次生代谢调控是分子生药学领域的热点问题之一［16］。因此，本研究利用基于超声法制取的穿心莲提取物纳米银颗粒，对甘西鼠尾草毛状根进行胁迫处理，探究AgNPs对毛状根生长及丹参酮合成与积累的影响。通过测定AgNPs胁迫下甘西鼠尾草毛状根生物量，利用HPLC法测定毛状根中隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA含量水平，采用qRT-PCR法检测AgNPs胁迫下丹参酮合成途径关键酶基因HMGR、DXR、CPS的相对表达水平，最终，从生长水平、药效成分含量差异及关键酶基因表达水平，初步揭示纳米银颗粒对甘西鼠尾草毛状根生长和药效活性成分合成与积累的调控作用，为丰富丹参酮类化合物生物合成与代谢调控研究、合理开发和利用甘西鼠尾草提供一定的理论与实践依据。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

HYQ-240S型全温双层摇床（常州爱华仪器有限公司）；ME 204型万分之一电子天平（Shimadzu，Japan）；101型电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；ZEN 3600型激光粒度仪（Malvern，UK）；美国Waters e2695高效液相色谱仪（串联Waters 2998 PDA检测器，自动进样器，Breeze2色谱工作站）；NanoDrop OneC超微量核酸蛋白浓度检测仪（Thermo Scientific，USA）；XRS+化学发光系统（Bio-Rad，USA）；qTower实时荧光定量PCR仪（Analytik Jena，Germany）。

1.2 试验材料与试剂

甘西鼠尾草毛状根由本实验室利用发根农杆菌Agrobacterium rhizogeneATCC 15834侵染甘西鼠尾草无菌苗叶片获得［17］。隐丹参酮（98%，批号：H02J11X107396）、丹参酮I（98%，批号：K04J12B136 345）、丹参酮IIA标准品（98%，批号：Y16M10C8848 7）购自上海源叶生物科技有限公司；色谱乙腈、甲醇（HoneyWell，USA）；SteadyPure植物RNA提取试剂 盒（AG21019）、Evo M-MLV反 转 录 试 剂 盒（AG11705）、SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒（AG11718）购自湖南艾科瑞生物工程有限公司，其余常规试剂均为国产分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 纳米银颗粒制备

取穿心莲干燥粉末2.5 g，加入50 mL ddH2O超声4 h，得穿心莲水提液；过滤，滤液加NaOH调节pH至10；将穿心莲水提液与等量10 mM硝酸银溶液混合，50℃超声处理3 h；9 000 r/min离心30 min，收集沉淀，超纯水冲洗3次，即得。

1.3.2 毛状根培养与处理

取甘西鼠尾草毛状根0.3 g，转接至装有50 mL 6，7-V液体培养基（含30 g/L蔗糖，pH 5.8）的锥形瓶中，置于摇床中避光培养21 d（25℃、120 r/min）。设置3个AgNPs处理浓度：吸取适量AgNPs母液加入培养基中，使其终浓度分别达到50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L，添加等体积无菌水作为对照（0 mg/L）；每个处理设3个生物学重复，处理7 d后测定毛状根生物量和药效成分含量。

1.3.3 毛状根生物量测定

毛状根处理结束后，用蒸馏水反复冲洗3次，滤纸吸干表面水分，精密称量鲜重；随后置于40℃烘箱中烘干至恒重，分别记录干重。

1.3.4 样品制备与丹参酮含量测定

精密称定0.05 g甘西鼠尾草毛状根粉末，加入8 mL 70%甲醇，静置过夜；超声处理30 min，静置；取上清液，利用0.22 μm孔径有机相微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。精密称定隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA标准品适量，加甲醇制成丹参酮混合标准品溶液（隐丹参酮5.45 μg/mL；丹参酮I，11.6 μg/mL；丹参酮IIA，12.4 μg/mL）。HPLC色谱柱：Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.02%磷酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脱程序参照文献并做部分改动［18］：0～10 min，95%～80%A；10～15 min，80%～75%A；15～20 min，75%A；20～25 min，75%～80%A；25～28 min，80%～70%A；28～40 min，70%A；40～45 min，70%～55%A；45～50 min，55%～50%A；50～58 min，50%～42%A；58～67 min，42%～50%A；67～70 min，50%～40%A；70～80 min，40%～35%A；80～85 min，35%～0%A；85～95 min，0%～95%A，流 速1.0 mL/min，柱温30℃，进样量20 μL；检测波长270 nm。

1.3.5 线性关系考察

精密吸取“1.3.4”中混合标准品溶液2 μL、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL，分别注入液相色谱仪，以进样量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标进行线性回归分析，隐丹参酮：y=4 296 486.2x-13 908.8，r=0.999 8（保留 时 间63.813 min）；丹 参 酮I：y=5 342 189.7x-24 695.0，r=0.999 9（保留时间64.743 min）；丹参酮IIA：y=5 738 812.5x-17 996.7，r=0.999 9（保留时间76.810 min）。混标溶液与样品提取液HPLC色谱图见图1。

图1 丹参酮类成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram profile of tanshinone components

1.3.6 毛状根总RNA提取

分别在100 mg/L AgNPs处理毛状根0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和7 d时取样，蒸馏水冲洗3次，无菌滤纸吸干水分，锡箔纸包裹后投入液氮速冻，保存于-80°C冰箱待用；采用SteadyPure植物RNA提取试剂盒提取毛状根总RNA，并检测RNA浓度与质量。

1.3.7 基因表达水平检测

利用Evo M-MLV反转录试剂盒获得毛状根cDNA，反应体系：5×Evo M-MLVRT Master Mix 2 μL，总RNA 1 μL，RNase free ddH2O 7 μL；反应条件：37℃，15 min；85℃，15 s；4℃，∞。利用Primer Premier6.0软件，针对丹参UBQ、HMGR、DXR、CPS基因序列设计qRT-PCR引物，引物序列见表1。采用SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒检测上述基因相对表达水平，反应体系：2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL，正反引物各0.8 μL，cDNA 1 μL，RNase free ddH2O 8.2 μL；反应条件：预变性：95℃，30 s；变性：95℃，5 s；退火/延伸：60℃，30 s；40次循环。以丹参UBQ基因作为内参基因，以未添加AgNPs毛状根作对照，利用2-△△ct法计算不同处理时间各个基因的相对表达水平。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of real-time quantitative reverse transcription PCR

1.3.8 数据处理与分析

采用SPSS 22.0软件中Duncan法进行多组样本间差异显著性分析，利用Origin 9.0作图。

2 结果与分析

2.1 AgNPs表征

激光粒度仪测定结果显示：穿心莲水提液超声制备的纳米银颗粒平均粒径为46.55 nm，粒度分布均匀，溶液均一稳定，可用于后续胁迫处理。

2.2 纳米银胁迫对甘西鼠尾草毛状根生长的影响

2.2.1 形态变化

如图2所示，对照组（0 mg/L）甘西鼠尾草毛状根外观呈浅黄褐色，生长旺盛，质地柔软且含水量大；随着外源AgNPs处理浓度增加，毛状根色泽逐渐加深，100 mg/L AgNPs处理的毛状根表面呈深棕褐色，与对照组相比生长状况较差，表现出较明显的胁迫特征。

图2 不同浓度纳米银胁迫处理甘西鼠尾草毛状根形态比较Fig.2 Morphology comparison of S.przewalskii hairy roots under different concentrations of AgNPs stress

2.2.2 鲜重和干重

由表2可知，纳米银胁迫对甘西鼠尾草毛状根的生长总体表现为抑制作用。毛状根鲜重以75 mg/L AgNPs处理的抑制效果最为显著，相比对照组降低32.98%（P＜0.05）；不同浓度AgNPs处理毛状根干重相比对照组则无显著变化。同时，毛状根含水量在添加纳米银颗粒后下降明显，其中100 mg/L AgNPs处理使毛状根含水量显著下降，相比对照组降低2.36%（P＜0.05）。总体而言，纳米银胁迫对甘西鼠尾草毛状根生物量积累具有一定的抑制作用。

表2 不同浓度纳米银胁迫处理甘西鼠尾草毛状根生物量比较Tab.2 Biomass comparison of S.przewalskii hairy roots under different concentrations of AgNPs stress

2.3 纳米银胁迫对3种丹参酮类成分积累的影响

不同浓度纳米银胁迫处理7 d后，甘西鼠尾草毛状根隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA含量变化如图3所示，随着AgNPs浓度的增加，丹参酮类成分含量均呈上升趋势。50 mg/L AgNPs胁迫处理毛状根7 d，隐丹参酮含量相比对照组（0 mg/L）显著上升（P＜0.05），随着AgNPs处理浓度的增加，隐丹参酮一直保持在较高水平；100 mg/L AgNPs处理的毛状根中隐丹参酮积累速率放缓，含量达到1.375 mg/g DW，是对照组的16.01倍（P＜0.05）。丹参酮I在甘西鼠尾草毛状根中含量总体处于较低水平，外源AgNPs胁迫对丹参酮I积累的促进作用明显，100 mg/L AgNPs处理7 d后毛状根中丹参酮I可达（0.098±0.008）mg/g DW，显著高于对照组。毛状根中丹参酮IIA的积累受到外源纳米银胁迫的显著诱导，随着AgNPs浓度的升高，处理组丹参酮IIA的含量分别为对照组的4.241倍、5.13倍、6.55倍（P＜0.05），以100 mg/L AgNPs的促进作用最为明显。丹参酮类化合物是甘西鼠尾草主要药效成分之一，综合甘西鼠尾草毛状根生长状况和丹参酮类成分积累的差异性，旨在以获取大量丹参酮类化合物为主要目的，故选择100 mg/L作为纳米银胁迫浓度进行丹参酮生物合成关键酶基因表达水平分析。

图3 不同浓度纳米银胁迫对甘西鼠尾草毛状根丹参酮类成分的影响Fig.3 Effects of different concentrations of AgNPs stress on tanshinone accumulation in S.przewalskii hairy roots

2.4 纳米银胁迫对丹参酮生物合成途径基因表达水平的影响

2.4.1 RNA提取结果

经100 mg/L AgNPs胁迫处理不同时间的甘西鼠尾草毛状根总RNA提取结果如图4所示，总RNA条带单一、完整、清晰，能够满足后续基因表达水平分析研究。

图4 甘西鼠尾草毛状根总RNA电泳图Fig.4 Electrophoresis diagram of total RNA in S.przewalskii hairy root

2.4.2 基因表达水平影响

如图5所示，甘西鼠尾草毛状根HMGR基因相对表达量随着纳米银胁迫时间的增加表现为先升后降，整体变化趋势呈倒“V”字形。100 mg/L AgNPs胁迫处理初期，HMGR基因表达水平逐步上升，相对表达量均显著高于对照组；100 mg/L纳米银胁迫处理24 h时会强烈诱导HMGR基因的高表达，相对表达水平为对照组的22.97倍（P＜0.01）；处理7 d时HMGR基因表达水平相较于其它处理时间有所降低，但仍显著高于对照组，是对照组的4.21倍（P＜0.01）。

图5 纳米银胁迫对甘西鼠尾草毛状根HMGR基因表达水平的影响Fig.5 Effect of AgNPs stress on HMGR expression levels in S.przewalskii hairy roots

如图6所示，甘西鼠尾草毛状根DXR基因在受到纳米银胁迫处理期间，相对表达水平的变化趋势与HMGR基本一致。100 mg/L AgNPs胁迫处理前期，DXR相对表达水平随着处理时间的增加逐渐升高；AgNPs处理24 h时DXR基因相对表达水平达到最大值，是对照组的20.88倍（P＜0.01）；随后DXR相对表达水平迅速回落，在胁迫处理末期达到最低值，但仍显著高于对照组。

图6 纳米银胁迫对甘西鼠尾草毛状根DXR基因表达水平的影响Fig.6 Effect of AgNPs stress on DXR expression levels in S.przewalskii hairy roots

如图7所示，100 mg/L纳米银胁迫处理甘西鼠尾草毛状根时，CPS基因表达水平总体表现为“升高-降低-再升高-再降低”趋势。100 mg/L AgNPs处理毛状根6 h，CPS基因相对表达水平是对照组的3.24倍（P＜0.05），随后出现略微下降；在纳米银颗粒处理24 h时，CPS基因相对表达量达到最高水平，显著高于对照组（P＜0.01），与100 mg/L AgNPs胁迫诱导下HMGR、DXR基因表达水平的变化规律一致。在AgNPs处理后期，CPS表达水平相比胁迫处理24h时有所下降，依然保持在较高水平。

图7 纳米银胁迫对甘西鼠尾草毛状根CPS基因表达水平的影响Fig.7 Effect of AgNPs stress on CPS expression levels in S.przewalskii hairy roots

3 讨论

研究表明，AgNPs可释放出少量Ag+，对植物的生态毒理作用可能由其独特的物理化学表面特性和游离的Ag+共同起作用［10，20］，也有学者提出AgNPs诱导拟南芥产生氧化胁迫不依赖于其释放出的Ag+［11］。王荣等［13］发现低浓度Ag+能促进黑麦草生长，高浓度银胁迫下黑麦草生物量下降，根系长度减小，并且AgNPs对黑麦草根系的抑制作用强于同浓度Ag+，揭示纳米银粒径小、比表面活性高等特征与其植物毒害作用的关联性；Li等［7］利用Ag+处理绒毛鼠尾草毛状根，发现低浓度Ag+一定程度促进毛状根生长，随着Ag+浓度提高，毛状根生长受到显著抑制；徐蓉蓉等［14］利用高浓度AgNPs处理蒙古黄芪种子后，种子发芽率显著降低，平均发芽时间延长，幼苗胚根长、子叶大小等指标均受到抑制。因此，高浓度纳米银的对植物毒害作用更为明显。本研究中，纳米银颗粒显著抑制甘西鼠尾草毛状根生长，高浓度AgNPs胁迫下毛状根鲜重和含水量下降明显，说明AgNPs的大量积累对毛状根可能产生一定的毒害作用。同时，我们观测到毛状根表面颜色随AgNPs浓度的增加呈深棕褐色，一方面可能由于AgNPs的毒害作用导致细胞积累大量活性氧，毛状根表皮细胞受损；另一方面，组织化学定位［21］和拉曼光谱显示［22］，丹参酮类成分主要集中在丹参根周皮中，是丹参药材呈现砖红至红棕色的主要因素；甘西鼠尾草与丹参根的形态相似，故毛状根颜色加深可能也是丹参酮类化合物大量积累的直观体现。AgNPs抑制甘西鼠尾草毛状根生长并产生毒害作用的机制还需进一步研究。

Ma等［15］利用30 mg/Lβ-环糊精包被的AgNPs处理丹参毛状根7 d，总丹参酮含量显著上升，丹参酮生物合成途径HMGR、DXR、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合成酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXS）基因、CPS等关键酶基因的表达水平上调明显，多种抗氧化酶活性升高；然而在添加活性氧清除剂Vc后，上述基因表达水平受到明显抑制，说明ROS在AgNPs胁迫调控丹参酮生物合成过程可能发挥重要作用。本研究中，外源AgNPs胁迫处理导致甘西鼠尾草毛状根中隐丹参酮、丹参酮IIA大量积累，丹参酮I从痕量提高到（0.098±0.008）mg/g DW，以100 mg/L AgNPs的促进作用最为显著，丹参酮生源合成关键酶HMGR、DXR、CPS基因均高表达，与前人研究结果基本一致。HMGR、DXR分别作为萜类化合物生物合成MVA途径和MEP途径的两个关键酶，其表达水平决定多种次生代谢产物的含量；CPS催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸生成柯巴基焦磷酸，是二萜醌类丹参酮生物合成途径中游的关键酶之一［16］。

本研究初步证实了AgNPs对甘西鼠尾草丹参酮积累及其生源合成相关酶基因的正调控作用，对于利用AgNPs提高丹参酮类化合物产量具有一定的指导作用，有助于促进甘西鼠尾草这一资源型药用植物的高值化利用。后续将进一步探究AgNPs胁迫与机体ROS动态平衡、转录水平和代谢水平的关系，从分子水平阐明AgNPs参与调控丹参酮类活性成分生物合成的生物学机制。