铝佐剂含量检测方法的探讨

王平 综述，刘梅影 审校

国药中生生物技术研究院有限公司，北京 101111

从1926年Glenny 发现铝佐剂至今，铝佐剂的使用已有近百年的历史。至目前为止，铝佐剂是被批准应用于人类疫苗最广泛的佐剂，也是我国唯一获得临床批准使用的疫苗佐剂［1-4］。中国已上市含铝佐剂疫苗共17 种，涉及灭活疫苗、重组基因工程疫苗、亚单位疫苗和联合疫苗等多个疫苗类型，包括吸附百白破系列疫苗、甲 ／ 乙 ／ 戊肝系列疫苗、流感病毒系列疫苗以及森林脑炎灭活疫苗、双价肾综合征出血热灭活疫苗等［5-6］。

铝佐剂种类主要包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾、氢氧化铝和磷酸铝的混合系统以及与其他佐剂成分组成的佐剂系统，其中应用最广泛的为氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂［2］。铝佐剂的安全性和有效性均得到了充分验证［7-9］，其含量对疫苗的免疫原性和安全性均具有重要影响。一方面通过增强抗原递呈、增强Th2 细胞介导的适应性免疫应答、激活B细胞诱导抗体产生以及激活补体等作用增强疫苗的免疫原性；另一方面也存在安全隐患，可诱导过敏反应和产生神经毒性［10］。因此，国际上通过法规或通则的形式对铝佐剂的安全性限度标准进行了严格规定［2，11-15］：均以铝离子含量为单位计，世界卫生组织及欧盟为不高于1.25 mg ／ 剂，美国要求不高于0.85 mg ／ 剂；而目前上市疫苗铝佐剂多为 0.3 ~0.5 mg ／ 剂。因此在不影响抗体产生量的前提下，应尽可能降低疫苗中铝佐剂含量，采用能够达到预期人体有效性最小剂量的使用原则，尽可能降低临床不良反应风险发生［16-18］。

铝佐剂粒径的不均一性容易引起分装后每剂疫苗中铝佐剂含量不一致，从而使接种个体产生免疫效果差异。随着多肽疫苗、亚单位疫苗不断涌现，对疫苗佐剂的要求愈来愈高，对常规佐剂的改良研究也更加被重视起来，人们把目光从粒径不均一、颗粒大的常规铝佐剂投向纳米铝佐剂。纳米铝佐剂较常规铝佐剂具有更多的优点：①颗粒更小。常规铝佐剂在水溶液中形成1 ～20 μm 的颗粒，而纳米铝颗粒的直径小于200 nm。因此相同含量的纳米铝佐剂会具有更大的表面积和更强的吸附能力；②纳米铝佐剂增加了抗原结构稳定性，较常规铝佐剂不易脱出，且吸收更快、产生抗体时间更短；③纳米铝佐剂活性更强。微量纳米铝佐剂可使疫苗诱导更强的免疫应答［19-21］。纳米铝的应用会在很多程度上降低铝佐剂使用量，相应降低铝佐剂副反应的风险，但会对铝佐剂检测方法的灵敏度提出更高的要求。National Medical Products Administration 在 2019年12月发布的《预防用含铝佐剂疫苗技术指导原则》中建议：将铝佐剂和含铝疫苗粒径大小和分布纳入质量特性研究和日常控制的要求，这就使得单支疫苗的铝含量检测成为质量精准控制的发展方向。

目前含铝佐剂疫苗常用的铝含量检测方法为乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）滴定法，该检测方法是《中国药典》三部（2020 版）［5］推荐方法，其原理是用过量EDTA-2Na 与Al3+发生反应，再用锌滴定液滴定剩余EDTA-2Na，根据锌滴定液的消耗量计算供试品中铝佐剂含量。这种络合滴定法简单易行，是生物制品领域检测铝含量的经典方法，也是《欧洲药典》（第八版）［22］和WHO 推荐方法。但该方法存在不足之处：①根据指示剂颜色变化经目测确定滴定终点，易受人为因素影响；②灵敏度相对较低，为ppm 级别，检测样品一般需合并5 ~ 10 剂疫苗，不能检测出单剂疫苗的铝佐剂含量，不利于对疫苗的精准质量控制，这就需要灵敏度更高的检测方法才能适应检测需求。

目前国内外各行业铝含量检测方法主要有分光光度法、色谱法、原子吸收光谱法（atomic absorption spectrophotometry，AAS）及电感耦合等离子体法（inductive coupled plasma emission spectrometry，ICP）等。根据检测原理及灵敏度不同，检测方法应用领域也有所不同。分光光度法多应用于食品领域，原子吸收光谱法多应用于环境和化药领域。这些方法对于疫苗中铝佐剂含量检测大多具有局限性，尤其是光谱方法，需要样品预处理，即将疫苗样品用湿式消解法（如硝酸消解法、硝酸-高氯酸消解法等）或微波消解，将其转化为可溶的试样。对于离子色谱法，为了测定复杂样品中的铝含量，经常需对基质进行预浓缩和 ／ 或净化，将不溶性的铝转化为可溶性的Al3+，同时又能排除疫苗中其他成分对检测的干扰。以下我们对这些方法的原理、应用及优缺点作一介绍。

1 铬天青分光光度法

光度法测定铝的显色剂较多，其中以铬天青S为最佳。铬天青简称CAS，是一种酸性染料。Al3+和铬天青S 在弱酸性溶液中生成红色的二元配合物，最大吸收波长为545 nm，如果加入含长碳链的有机表面活性剂，如溴化十六烷基三甲基铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB），则可形成三元配合物；其最大吸收波长向长波方向移动（红移），测定灵敏度显著提高。目前食品中铝含量测定采用食品安全国家标准GB5009.182—2017 规定的铬天青分光光度法［23］。本方法原理为：在乙二胺-盐酸缓冲液中，聚乙二醇辛基苯醚（TritonX-100）和溴代十六烷基吡啶（bromohexadecyl pyridine，CPB）的存在下，Al3+和铬天青S 反应生成蓝绿色的四元胶束，于620 nm 波长处有特异吸收。分光光度法结果准确、操作简单、成本较低，但也存在许多不足：①检测过程步骤繁琐，所用试剂较多；②形成的络合物不稳定［24］；③灵敏度是 ppm 级，适用于铝含量较高（10 ~1 000 mg ／ kg）的情况［25］；④易受多种因素影响［26］；⑤使用大量有毒有害试剂，易造成环境的污染。

2 色谱法

目前国际上多采用色谱技术监测环境中微量铝含量，如反相高效液相色谱（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）-紫 外 检测法［27-28］、液质联用（liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS）［29］、离子色谱-柱后衍生法［30-31］等。USP37 在非处方药铝含量检测中，除了滴定法还介绍了液相色谱法和离子色谱法，但在生物制品领域尚未见应用色谱技术研究微量铝含量的报道。可能是疫苗类样品成分复杂，通过前处理对样品进行净化排除蛋白、多糖类抗原物质以及辅料成分对检测的干扰是该方法能否成功的关键。

2.1 RP-HPLC-紫外检测法 RP-HPLC 分离技术已被广泛应用于铝与8-羟基喹啉（8-hydroxyquinoline，8-HQ）、8-羟基喹诺酮磺酸（8-hydroxyquinoline sulfonate，8-HQS）等螯合剂形成的络合物分离。其中槲皮素（3，3′，4′，5′，7-五羟基黄酮）普遍存在于植物光合作用中，可与铝选择性地形成槲皮素-Al3+的络合物。REKHI 等［32］使用槲皮素作为金属络合剂通过RP-HPLC 和紫外检测器测定水样中痕量铝。首先采用织物相吸附萃取（fabric phase sorptive extraction，FPSE）技术从水样中预浓缩槲皮素-Al3+络合物，然后通过反相C18 色谱柱实现槲皮素-Al3+络合物的基线分离。新型FPSE-HPLC-紫外检测法可灵敏、准确、可靠地筛查各种水样中铝离子含量。

2.2 LC-MS 乙磷铝是一种植物杀虫剂，在空气中喷洒后对身体有害，BUIARELLI 等［33］采用选择性液相层析串联质谱分析（liquid chromatography tandem-mass spectrometry，LC-MS ／ MS）方法来分析空气颗粒物质中的乙磷铝残留量。用Strata X 固相萃取技术从9 L 大气颗粒物中采样分析，用亲水聚合物填料色谱柱和水 ／ 乙腈分步洗脱实现色谱分离，再用质谱检测以多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式在负电喷雾电离（electron spray ionization，ESI）中运行。结果表明，该方法简便、快速、适用于固体性质样品检测，可考虑应用于其他种类样品，如食物或土壤。

2.3 离子色谱-柱后衍生 该方法检测原理是利用Al3+与Tiron 衍生试剂在酸性条件下生成衍生物，在310 nm 波长处有特异吸收峰。通过阳离子螯合树脂CS5 层析柱完成铝的选择性预浓缩以及铝与其他过渡金属及碱性金属分离，再通过柱后衍生生成有紫外发色团的衍生物。国药中生生物技术研究院有限公司中心实验室建立了高温干烤后加酸溶解的样品前处理方法，解决了色谱技术检测疫苗类产品的关键步骤。该方法可明显提高铝检测的灵敏度和精确度，相较于滴定法减少了人为操作误差，具有设置简单、运行速度快等优点，有利于对样品进行精准质量控制。

2.4 AAS

该方法为目前微量元素检测的经典方法［34-38］，也是实验室应用最广泛的方法，是基于被测元素基态原子在蒸气状态对其原子共振辐射的吸收进行元素定量分析的方法。该方法选择性强，灵敏度高，分析范围广，目前可测定的元素种类已达70 多种。美国环境保护局出版的《水和废水化学分析方法》明确指出水中34 个金属用AAS 进行测定；日本的工业标准（Japanese Industrial Standard，JIS）和我国水质监测也明确使用ASS 检测的项目达15 项以上。国际标准组织（International Organization for Standardization，ISO）近几年也在为把ASS 列为标准方法进行积极工作。原子吸收光谱仪的关键部件是原子化系统，按照原子化装置的不同可分为火焰原子吸收光谱法（flame atomic absorption spectrometry，F-AAS）、石墨炉原子吸收法（graphite furnace atomic absorption spectrometry，GF-AAS）和氢化物发生原子吸收光谱法（hydride generation atomic absorption spectrometry，HG-AAS），适合检测铝元素的为前2 种方法。

2.4.1 F-AAS 该方法具有准确性好、操作简单、成本较低、检测时间短等优点，广泛应用于环境分析、农业、冶金、石油工业等多个领域［39-43］。武慧欣等［44］采用传统湿法消解处理蔬菜样品，用F-AAS 测定蔬菜中铜、锌、铅、镉含量。结果显示，4 种重金属元素浓度的标准偏差均小于0.03，回收率为在95% ～106%，检测限均小于 0.31 mg ／ L。

2.4.2 GF-AAS 与 F-AAS 相比，GF-AAS 具有灵敏度高、原子化效率高、测定元素范围广、进样量少以及利用率高等优点［45-49］。焦二虎［50］采用 GF-AAS测定土壤样品中铅、镉、钴、锑、铍含量，结果显示，各元素检出限为 0.008 ～ 0.06 μg ／ g，该方法检测结果准确、可靠。李墨等［51］用GF-AAS 测定生活水中的铝含量，结果显示，该方法操作简便、快速、准确、干扰小，方法检测限为3.315 μg ／ L，最低检出质量浓度为13.26 μg ／ L，适合生活用水中铝含量测定。虽然GF-AAS 检测精度高于F-AAS，但重复性不如F-AAS 好，干扰性也大，这是由于石墨管内部空间小，同时共存的基体物质在空间的密度明显增加，增加了其与被测元素间的相互作用机会，产生的气相干扰较F-AAS 严重，基体干扰也较严重，使得GF-AAS的准确度要低于F-AAS。在检测铝含量时，特制石墨管内有锆盐涂层，且铝元素较为活泼，不易保证检测结果准确性，尚需继续改进。

2.4.3 HG-AAS HG-AAS 的显著优点是干扰小、重复性好。不足之处为：①原子化效率不足30%，因此相应样品进样量大，为10 ~ 20 mL，浪费样品；②灵敏度不高，为ppm 级，痕量分析需对样品进行预分离富集；③关键部件损耗大；④火焰由乙炔气体产生，乙炔有难闻臭味且易燃，存在安全隐患。在检测铝元素时，由于铝元素电离能较高，空气-乙炔火焰无法满足要求，需使用一氧化二氮-乙炔火焰，因此危险性较高。

2.5 ICP

ICP 属于微量元素检测的新方法，也是目前备受关注的推荐方法［52-56］。其原理为：待测物质含元素发射的特征谱线，根据谱线存在与否和强度进行样品中相应元素的定性和定量分析。将样品经蠕动泵由氩气带入雾化系统进行雾化形成气溶胶，颗粒大且不均匀的气溶胶由废液口排出，颗粒小且均匀的气溶胶进入等离子体的轴向通道，在高温和惰性气氛中被充分蒸发、原子化、发生电离和激发，发出所含元素的特征谱线。根据检测器的不同可分为2 种类型，电感耦合等离子体光谱法（inductively coupled plasma-optical emission spectrometer，ICP-OES）和电感耦合等离子体质谱法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）。这两种检测方法的激发源均为电感耦合，ICP 通过全谱直读／ 单道扫描的方式进行光学测定，线性范围宽、可同时对多种元素进行检测分析［57-60］，从而实现样本的高通量检测。ICP 广泛应用于环境、食品、生物医药等多种领域。

2.5.1 ICP-OES 光谱仪所用检测器为CCD 检测器，需要通过分析外标物得到标准曲线，然后对待测物开展定量分析。用该方法检测13 价肺炎球菌结合疫苗中铝含量，检出限为 0.015 μg ／ mL，方法准确度和精密度均良好［61］。缺点是仪器价格昂贵，氩气消耗量较大，全程需氩气吹扫及电离，在基层单位推广应用具有一定困难。

2.5.2 ICP-MS 原理同ICP-OES，不同之处在于检测器为质谱检测器，以质谱测量峰型，灵敏度可达ppb ~ ppt 级，可实现样本中痕量元素检测，检测范围较光谱法更广泛，常用在包材相容性检测中［62-64］。但质谱检测更易受到干扰，且该方法不可使用干法消解法处理样品，因为坩埚会吸附一定量的铝元素而影响检测结果准确性。不足之处为：①设备昂贵，维护费用高；②对操作人员要求较高，且需要自建方法，根据待测元素及其样品中的干扰杂质，选择合适的检测波长，既要保证待测元素有最大吸收又要排除杂质的干扰；③质谱检测器比较精细，受外界干扰较大。因此，ICP-MS 的准确性和稳定性也备受大家关注。

3 结 语

以上几种铝含量检测方法，就灵敏度而言，EDTA-2Na 滴定法和铬天青分光光度法灵敏度较低。EDTA-2Na 滴定法不能检测单剂疫苗中铝佐剂含量，需合并5 ~ 10 支疫苗进行检测，不能对疫苗进行精准质量控制；目测滴定终点，易产生人为误差。而分光光度法操作步骤繁琐，检测过程中会用到有毒有害试剂，易造成环境污染。

色谱法、AAS 和ICP 灵敏度显著提高，能够实现单剂疫苗的检测，实现了对疫苗质量的精准质量控制，为研发过程中铝佐剂制备工艺、抗原吸附工艺和分装工艺优化提供了有效的判断手段。但这3 种方法均需对样品进行前处理来满足检测需要。其中FAAS 原子化效率较低，比较浪费样品，但干扰小，重复性好；相反，GF-AAS 原子化效率较高，进样量小，但由于内部空间狭小导致干扰大，重复性差。尤其F-AAS 使用易燃的乙炔气体，存在安全隐患。

ICP-OES ／ ICP-MS 法是近几年微量元素检测的新兴方法，显著优点是可以同时检测多种元素，满足了各国药典对铝佐剂不断提高的质控要求，可在检测铝含量的同时检测砷、铁等重金属元素，大大减少了工作量，符合未来发展的需求，但缺点是仪器价格昂贵，维护成本高。

综上所述，实验室可根据自己的实验要求和条件选择合适的检测方法。