纳米生物传感器在肿瘤microRNA-21检测中的应用

牛亚倩，刘芳 综述，陈彻 审校

甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000

目前已发现大量miRNAs 在人类肿瘤中上调或下调，发挥促癌或抑癌的功能，在肿瘤的发生、侵袭转移和治疗耐药等方面发挥重要作用［1］。microRNA-21（miRNA21，miR-21）是最早发现的人类 miRNA之一，其基因位于17 号染色体q23.2 区域，位于跨膜蛋白49（TMEM49）基因，也称人液泡膜蛋白1（vacuole membrane protein-1，VMP1）基因的内含子区域［2］。多项研究表明，miR-21 在结肠癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、肾细胞癌和神经胶质瘤等癌症中异常增高，且在肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡中发挥至关重要的作用［3-8］。此外，miR-21 水平升高与晚期肿瘤淋巴结转移、肿瘤大小和患者总生存期降低有关［9］。也有研究显示，miR-21 过表达是慢性粒细胞白血病患者有效监测药物反应和治疗结果的分子预后标志物及预测工具［10］。miR-21 在肿瘤的发生及进展中起重要作用，在诊断多种肿瘤中表现出较高的灵敏度和特异度，可能成为临床上新的肿瘤早期诊断及预后标志物［11］。miRNA 分析的常用方法有逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Northern blotting、微阵列技术等。但这些方法通常耗时长，成本高，设备要求高，灵敏度低，假阳性高［12］。在过去的几十年里，生物传感器作为一种快速、可靠和精确的分析方法，在全球医疗中得到了广泛应用［13］。

本文对近年来不同纳米材料的生物传感器在肿瘤miR-21 检测中的研究进展作一综述，为肿瘤的早期诊断和预后评估奠定基础。

1 纳米生物传感器

受天然生物传感启发，人工生物传感以生物分子为敏感元件，物理化学器件为换能器，通过特异性分子识别，将生物反应转换成物理化学信息，再通过物理化学换能器转换为可定量的信号［14］。基于不同换能原理将纳米生物传感分为：电生物纳米传感、光学纳米传感（紫外-可见光谱型、荧光光谱型、拉曼散射型、表面等离子共振光谱型）、纳米声波生物传感、磁性纳米生物传感、力学纳米生物传感［15］。随着纳米技术的进步，不同类型、形状和大小的纳米材料应用于生物传感器，以提高检测的灵敏度和准确性［16-18］。用于生物传感的纳米材料有碳纳米材料（碳纳米管、石墨烯和炭黑）、纳米金、纳米金属氧化物（纳米氧化锌）、DNA 生物纳米传感结构及一些聚合物材料等［19］。相比传统的生物传感，纳米生物传感器具有更好的灵敏度、高通量和重复性。各种纳米技术和纳米材料的应用，也将更有利于生物传感器的小型化、微型化、可携带、可穿戴等，从而发展出针对肿瘤诊疗更多、更先进的传感模式［15］。

2 纳米生物传感器检测miR-21

2.1 石墨烯纳米生物传感器 各项研究已表明，石墨烯纳米复合材料表现出增强的热稳定性和电化学活性以及气体阻隔性能。这些复合材料中石墨烯的存在改善了生物材料的机械／ 电气性能，增加了生物材料表面的细胞附着和生长，广泛应用于生物传感器领域［20］。SALAHANDISH 等［21］在石墨烯生物传感器上利用电化学方法固定上银纳米颗粒（AgNPs）以及聚苯胺（polyaniline，PANI），再在该纳米复合物上结合与miRNA 互补的DNA 探针，采用电化学伏安法检测 miRNA，线性范围为 10 fmol／L ～ 10 μmol／L，检出限为 0.2 fmol ／ L，具有很高的灵敏度。而且，该生物传感器能高选择性地识别miR-21 与非互补序列，其高选择性不受检测缓冲液的基质效应影响。上述实验结果表明，该石墨烯纳米生物传感器能够直接用于检测临床样本中的miR-21，且不需要进行预处理，如分离细胞、核酸提取和扩增等，有望提高乳腺癌相关miRNA 检测的灵敏度和检出效率，从而实现乳腺癌的早期诊断。RYOO 等［22］提出了一种基于肽核酸和纳米级氧化石墨烯组成的新型生物传感器，这种高通量筛选策略可识别调节活细胞中miR-21 表达的小分子。通过测量活细胞中目标miR-21水平对应的定量荧光信号，可同时监测与miR-21 表达相关的表型细胞变化，这种新型生物传感器为发现活细胞中miRNA 表达的调节机制提供了新的检测手段。

2.2 金纳米粒子（AuNP）s／氮化碳纳米片（carbonnitride nano sheet，CNNS）复合物生物传感器 AuNPs 具有良好的生物相容性和导电性、有效的催化作用、高密度、高的表面与体积比等优良性能［23］，并且可与含氮基团形成稳定的化学键［24］，在生物测定领域得到了广泛应用。有研究者开发了一种基于AuNPs ／CNNS 复合材料的电化学生物传感器，用于检测miRNA，利用双特异性核酸酶（duplex-specific nuclease，DSN）和发夹结构探针分别提高了灵敏度和选择性，所报道的生物传感器显示miR-21 的检测范围在10 fmol／L ～1 nmol ／ L 之间，检测限低至 2.9 fmol ／ L。此外，对血清样品中添加的miR-21 检测表明，所研制的生物传感器具有良好的选择性、稳定性和重现性，验证了其在疾病早期诊断中的应用潜力［12］。

2.3 DNA 纳米生物传感器 DNA 不只是遗传物质，还能通过折叠形成特定的二维、三维结构，作为一种天然纳米材料，可参与各种功能结构和纳米器件的构造，对纳米科学产生了重大影响［25］。自组装DNA纳米结构作为一种新型纳米生物材料，可精确排列各种分子和材料，形成空间有序的复合物，因此，DNA纳米结构在许多生物医学领域尤其是生物传感器中显示出巨大的应用前景［26］。能够快速、高效地组装出具有强大的miRNA 测定功能的DNA 纳米材料，是DNA 纳米生物技术和基础生物医学研究的关键。研究者提出了一种新的靶标触发DNA 组装途径，通过将DNA 级联体与G-四链体导线相结合来构建多分支DNA 纳米结构。由于在电极表面聚集了大量的G-四链体重复，所获得的多分支DNA 纳米结构能够与大量的氯化血红素结合，从而使电化学传感信号显著放大，用于对miR-21 的超灵敏和选择性检测。检测下限低至0.2 fmol／L，动态响应范围为10 fmol／L ～100 nmol ／ L。此外，即使是单碱基突变也可很容易地与目标miR-21 区分开。因此，其为构建多功能放大传感平台开辟了一条很有前景的途径，在基于DNA的生物分析和临床诊断领域显示出极大优势［27］。

ZHAO 等［28］设计了一种基于 DNA 四面体纳米结构和荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）的同时检测 miR-21、miR-122和miR-223 的新方法。以miR-21 为靶模型，DNA 四面体纳米结构是检测miRNA 表达的可靠而有效的方法，检测范围为0.02 ~ 10 nmol ／ L。在人血清样本中也证实了可同时检测miRNA。这种简单的检测方法有利于估计肿瘤的进展阶段，并做出治疗决策。此外，该方法还可应用于其他生物标志物的检测，在癌症的诊断和治疗中起至关重要的作用。

2.4 氧化锌（ZnO）纳米生物传感器 由于ZnO 纳米材料具有无毒性、生物相容性、良好的导电性和较大的比表面积等特性，拓宽了其在生物传感器领域的应用［29］。ZHANG 等［30］设计了一种 ZnO 纳米生物传感器，在ZnO 表面直接修饰鲁米诺，缩短了电子传输距离，降低了能量损失。其次，采用ZnO 作为新的共反应促进剂，加速了溶解氧的还原，显著提高了鲁米诺的电化学发光效率，实现了对癌细胞中miR-21 的超灵敏检测，该生物传感器检测限低至18.6 amol ／ L。总的来说，这项研究利用了一种新的协同反应加速器，作为一种高效放大方法用于超灵敏检测和分析，为生物分析领域提供了一种新的方法，也为肿瘤生物标志物监测提供了一种新的策略。

3 小结与展望

纳米技术的发展为医学领域的关键问题提供了解决方案，本文以miR-21 为例，总结了近几年几种新型纳米生物传感器用于miRNA 的检测，在肿瘤的早期诊断、预后评估及治疗监测中显示出巨大优势。在各种生物样本中以超低浓度、高选择性地测量miRNA的能力在临床诊断中具有很大意义，并有待直接对人体样本（如组织、血液或尿液）进行充分探索。理想的用于miRNA 的纳米生物传感器将需要最少或不需要样品制备或预处理，并将为许多疾病的早期诊断提供理想的检测手段。该领域未来应进一步研究肿瘤相关样本中miRNA 的高通量筛选及对miRNA完整的分析，设计可同时检测多种miRNA 的纳米生物传感器。随着纳米技术的发展，纳米生物传感技术将为精准医疗带来新的机遇，将有更多的纳米材料被开发出来，以满足生物医学的需求。