铜绿微囊藻对蒙古裸腹溞生殖及抗氧化酶的影响

邢 浩，陈桃英，段元亮，郜晓峰，刘 炜，钟逸云，张建琳， 常佳楠，孙 彬，何培民

( 1.上海海洋大学 海洋生态与环境学院，水域环境生态上海高校工程研究中心，上海 201306; 2.上海海洋大学 水产与生命学院，水域生态学实验室，上海 201306 )

近年来，随着水体污染的加剧，微囊藻水华成为国内外广泛关注的话题[1]。铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)通常是蓝藻水华暴发的优势种，在富营养化水体中能够快速繁殖。杨娜等[2]发现，在杭州湾金山城市沙滩低盐度封闭海域存在铜绿微囊藻，夏季微囊藻成为当地优势种，暴发时藻密度可超过1×107个/mL。这一现象不仅破坏了水体的生物多样性和水域生态系统结构的稳定性，还影响了当地水产养殖业和旅游业的发展；并且微囊藻会产生藻毒素，其毒性会影响浮游动物的生长和繁殖[3]。而枝角类动物作为水体生态系统的重要组成部分，是维持水体生态系统平衡和能量流动的重要环节，在水体中通常扮演初级消费者的角色[4]。环境因子对枝角类动物生活史的影响已有研究[5-6]，戴曦等[7-9]也做了大量微囊藻对淡水枝角类生活史特征影响的研究，但在低盐度封闭海域水体生态系统中微囊藻与浮游动物之间的生态关系尚未见报道。

微囊藻毒素的释放会对浮游动物的种群增长、生长繁殖、生理功能产生影响，微囊藻毒素会改变环境中动物体内氧化还原的稳定状态，并产生引起细胞氧化压力以及损害DNA和蛋白结构的活性氧[10]，所以抗氧化防御系统在动物体内占据着重要地位。目前纳米材料和重金属对枝角类动物抗氧化防御的影响研究较多[11-12]。对于盐水枝角类抗氧化系统在微囊藻毒素胁迫下的研究，既可以丰富水生动物生理学，又能反映水环境中微囊藻毒素的存在对于生态环境污染监测的作用。

蒙古裸腹溞(Moinamongolica)是一种广盐广温的枝角类动物，它具有生长周期短、繁殖迅速、营养价值高、易培养、可塑性高、对环境变化敏感等优势，因此可作为潜在的毒性测试受试动物[13]。关于它的研究集中在其对有机污染物和重金属毒性测试方面[14-16]。因此，笔者选取蒙古裸腹溞作为受试生物，旨在探讨有毒铜绿微囊藻对盐水枝角类的生长繁殖以及氧化还原效应的影响，以此来评估蓝藻水华的生态风险，为后续的富营养化的河口区、滨海区的蓝藻水华治理工作提供相应的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

有毒铜绿微囊藻(M.aeruginosa) FACHB 905购自中国科学院武汉水生生物研究所，室内显微镜观察为单细胞藻种。藻种在无菌条件下利用BG-11培养基接种扩培，于温度(25±1) ℃、光照度3000 lx、光暗比12 h∶12 h、盐度8、pH 7.2的光照培养箱中培养。培养期间每日定时摇晃3次，及时镜检藻种的生长情况，试验选择对数期生长后的藻种。海水小球藻(Chlorellasp.)使用f/2培养基进行培养，其他培养条件与有毒铜绿微囊藻一致。

蒙古裸腹溞为采自晋南硝池，于上海海洋大学水产与生命科学学院水域生态学实验室经数十年培养而保存下来的溞种。试验开始前4个月将溞种驯养在盐度8(自来水和盐卤配制而成，使用前经过滤、煮沸)、温度21～28 ℃的半咸水中，以小球藻为饵长期培养。试验中的蒙古裸腹溞是由同一母体繁殖3代以上的1 d幼龄期的健康幼溞。

动物组织中氧化还原酶(超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性)的测定均采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行。

1.2 试验条件

试验用经过滤、煮沸的盐卤和自来水配制而成的海水将有毒铜绿微囊藻藻液稀释成不同藻密度，所有试验在光照培养箱中进行，温度25 ℃、光照度3000 lx、光暗比12 h∶12 h、盐度8，试验中所用容器为150 mL烧杯。细胞计数是通过将有毒铜绿微囊藻和小球藻的藻液分别稀释成不同倍数，使用紫外分光光度计测量在680 nm时的吸光值，在显微镜下使用XB-K-25型血球计数板对藻细胞数目进行计数，进而建立藻细胞数目与680 nm吸光值之间的线性关系，得出单位体积的藻细胞数，用来表示2种藻的藻液密度。

1.3 试验设计

1.3.1 有毒铜绿微囊藻对蒙古裸腹溞生活史影响试验

依据预试验致死密度范围，设置1×105、1×106、1×107、5×107个/mL 4个有毒铜绿微囊藻处理组、对照组(小球藻)和禁食组(无饵料)。由于小球藻是蒙古裸腹溞的天然饵料，作为对照组。藻密度设为3×106个/mL，此密度为蒙古裸腹溞的最适培养密度。每个处理设3个平行，挑选20只健康新生幼溞放入装有100 mL试验水样的烧杯里。每日记录蒙古裸腹溞死亡个数及产幼量(将母体与新生幼体分离，并将新生幼体移出烧杯)。试验以烧杯中的蒙古裸腹溞全部死亡结束。

1.3.2 混合投喂有毒铜绿微囊藻与小球藻对蒙古裸腹溞生活史影响试验

将有毒铜绿微囊藻与小球藻按一定比例搭配(表1)。每个处理组3个平行。选择新生幼溞放入装有100 mL试验水样的烧杯中，每个烧杯中放置20只，试验过程中，每日更换藻液1次，记录存活数量、首次产幼时间、产幼数量、最后产幼时间。烧杯中的动物全部死亡时，试验结束。

表1 混合投喂试验中不同处理组的藻类组合

1.3.3 酶活性测定试验

将有毒铜绿微囊藻与小球藻按一定比例搭配(表2)。设置1个对照组(小球藻)和2个处理组(混合饵料组、有毒铜绿微囊藻组)，每个处理设置3个平行，挑选新生幼溞放入1 L试验水样的烧杯中，每个烧杯中放置1000只，试验共进行96 h。每隔24 h 挑出存活的幼溞使用生理盐水反复洗涤去除动物身上的藻液杂质，放在滤纸吸干水分，然后称取组织质量后，加入9倍体积的生理盐水，用研磨棒充分匀浆，将制备好的组织匀浆液用高速冷冻离心机4 ℃、3000 r/min(离心半径13.5 cm)离心10 min，离心后取上清液测定超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性。

表2 酶活性测定试验中不同处理组的藻类组合

1.4 数据处理

根据试验记录编制蒙古裸腹溞的生命表，计算净生殖率(R0)、世代时间(T，d)、内禀增长率(rm)[17]，其中：

T=∑x×lx×mx/∑lx×mx

(1)

R0=∑lx×mx

(2)

rm=lnR0/T

(3)

式中，x为日龄，lx为x龄蒙古裸腹溞的存活率(%)，mx为x龄蒙古裸腹溞的生殖率(%)。

试验数据用Prism 7.04软件进行绘图，用 SPSS 25.0统计分析软件进行单因素方差分析，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 不同藻密度的有毒铜绿微囊藻对蒙古裸腹溞生长繁殖的影响

在不同藻密度的有毒铜绿微囊藻处理组中，蒙古裸腹溞的存活率随着藻密度的提高而不断降低，且幼溞最大寿命不超过6 d。高密度处理组(5×107个/mL)幼溞在第2天死亡，而对照组中幼溞的最大存活时间一直显著高于其他处理组(df=5,F=1494.08,P=2.49×10-16)，幼溞在第34天全体死亡(图1)。禁食组的寿命高于有毒铜绿微囊藻处理组，且试验结果显示，蒙古裸腹溞在单一有毒铜绿微囊藻处理组和禁食组的生殖率均为0。

2.2 有毒铜绿微囊藻与小球藻混合投喂对蒙古裸腹溞生长繁殖的影响

在100%小球藻处理组中，幼溞在试验结束时的存活时间明显高于其他处理组，为34 d(F=86.00, df=4,P=1.77×10-10)。100%有毒铜绿微囊藻处理组中幼溞存活率一直低于其他处理组，且在第8 天全部死亡。而在其他混合饵料组中，小球藻藻密度占比越大，蒙古裸腹溞的寿命越长(图2)。

图1 不同密度铜绿微囊藻下的蒙古裸腹溞的存活率Fig.1 The survival rate of water fleas M. mongolica exposed to different densities of M. aeruginosa

图2 混合饵料不同处理组下蒙古裸腹溞的存活率Fig.2 The survival rate of water fleas M. mongolica in different treatment groups

在混合饵料下，各处理组的首次产幼时间均在第4 天(表3)，在整个试验期间，100%小球藻组的首次产幼数量、最后产幼时间、产幼总数、平均产幼量显著高于其他处理组(F=391.79, df=3,P=5.13×10-9；F=193.50, df=3,P=8.36×10-8；F=18 399.26, df=3,P=1.09×10-15；F=18 399.26, df=3,P=1.09×10-15)，并且首次产幼数量、产幼总数和平均产幼量均随有毒铜绿微囊藻占比增高而减少。

表3 混合饵料下各处理组蒙古裸腹溞的种群增长参数

5个处理组中，100%小球藻组的净生殖率、世代时间和内禀增长率显著高于其他处理组(F=375 714.96, df=4,P=7.83×10-26；F=299 928.74, df=4,P=2.41×10-25；F=578.64, df=4,P=8.81×10-12)。蒙古裸腹溞在100%铜绿微囊藻组的净生殖率、世代时间以及内禀增长率均为0。而在其他3个处理组中蒙古裸腹溞的净生殖率和世代时间随铜绿微囊藻密度上升而降低，3个处理组的内禀增长率差异不显著(F=1.617,df=2,P=0.27)。

表4 混合饵料不同处理组下蒙古裸腹溞种群增长参数

2.3 不同食物条件下蒙古裸腹溞体内抗氧化酶活性变化

96 h内摄食单一铜绿微囊藻以及混合饵料，蒙古裸腹溞体内的超氧化物歧化酶活性不断降低(图3)。与小球藻组(对照组)相比，其中在48、96 h时，有毒铜绿微囊藻组的超氧化物歧化酶活性降低46%、48%(F=236.88,df=1,P=1.04×10-4；F=316.53,df=1,P=5.90×10-5)。而混合饵料组的超氧化物歧化酶活性一直高于有毒铜绿微囊藻组。在48 h后混合饵料组的超氧化物歧化酶活性下降趋于稳定，而有毒铜绿微囊藻组在后期呈下降趋势。

图3 不同食物条件下蒙古裸腹溞体内超氧化物歧化酶活性变化Fig.3 Changes in superoxide dismutase activity in water fleas M. mongolica under different food conditions不同处理组中标有不同小写字母表示组间有显著差异(P<0.05)，标有同一小写字母表示组间无显著差异(P>0.05)；下同.Means with different letters are significant differences between groups (P<0.05), and means with same letter are not significant differences between groups (P>0.05); et sequentia.

24 h时，小球藻组与混合饵料组、有毒铜绿微囊藻组的过氧化氢酶活性差异显著(F=37.95, df=2,P=3.93×10-4)(图4)，混合饵料组中过氧化氢酶活性高于小球藻组，有毒铜绿微囊藻组的过氧化氢酶活性最低。与小球藻组相比，混合饵料组的过氧化氢酶活性下降幅度变大。96 h内，小球藻组的过氧化氢酶活性总体呈不断上升的趋势，而在48 h后混合饵料组的过氧化氢酶活性低于小球藻组，并随时间不断下降。

图4 不同食物条件下蒙古裸腹溞体内过氧化物酶活性变化Fig.4 Changes in catalase activity in water fleas M. mongolica under different food conditions

3 讨 论

3.1 铜绿微囊藻的毒性对蒙古裸腹溞生长的抑制作用

铜绿微囊藻在野外环境聚集成团，以群体形式存在，但在室内纯种培养为单细胞，且蒙古裸腹溞是滤食性动物，排除了铜绿微囊藻因群体过大无法滤食的可能。多种水生生物的研究已证明，微囊藻毒素可以在浮游动物、甲壳类、双壳类以及鱼类生物体内积累，甚至在某些水生脊椎动物体内积累[18-19]。微囊藻毒素是一种肝毒素，它对水生动物的肝脏、消化器官具有损伤作用[20-21]。本试验中，在不同藻密度的有毒铜绿微囊藻条件下，铜绿微囊藻对蒙古裸腹溞生长的毒害作用是不同的。随着铜绿微囊藻藻密度增加，其毒性作用增强，并且检测到试验中高密度到低密度的铜绿微囊藻胞外毒素MC-LR分别为150.00、12.00、1.40、0.15 μg/L，随着时间的推移，释放的毒素在动物体内累积，这是铜绿微囊藻抗牧食的本能应激反应，然而这种行为会影响蒙古裸腹溞的滤食，不利于蒙古裸腹溞长期生长，会造成蒙古裸腹溞死亡率提高，怀卵困难，且试验过程无繁殖现象。徐鑫李等[22]在研究大型溞与铜绿微囊藻的相互影响中发现，水体中铜绿微囊藻分泌的胞外藻毒素，以及被滤食消化后释放的胞内藻毒素均对大型溞具有毒性影响，并且微囊藻胞内毒素的影响大于其释放在水环境中的胞外藻毒素。据相关研究报道，微囊藻毒素可通过抑制特定的蛋白磷酸化，使自由和共价相互作用发生，从而影响浮游动物的存活、生长和繁殖[23]。

Asselman等[24]在探讨大型溞与有毒微囊藻的生态关系时观察到，微囊藻的毒害作用与微囊藻密度以及大型溞数量密切相关。Shahmohamadloo等[25]通过蛋白质组学分析，揭示铜绿微囊藻产生的微囊藻毒素对大型溞具有亚致死作用，毒素越强，大型溞的死亡率越高。这与本试验的结果相似。笔者也发现，相对于有毒铜绿微囊藻的存在，在禁食条件下的蒙古裸腹溞存活时间较长。一方面反映了有毒铜绿微囊藻对蒙古裸腹溞具有较严重的毒害作用，另一方面蒙古裸腹溞可能也会滤食水体中的有机碎屑和悬浮物，在无其他食物的条件下，又能展示出它对恶劣环境的耐受性。因此，笔者认为微囊藻毒素可能是影响蒙古裸腹溞生长繁殖的重要原因。

3.2 混合饵料对蒙古裸腹溞生长繁殖的影响

枝角类一般为广谱性牧食者，即对食物可食性不具有区分滤食的能力，当食物中含有产毒蓝藻(单细胞)，枝角类只能降低摄食强度(如减少吞咽)，减少有毒藻的摄入，但这种方式也会造成其无法吸收其他重要营养物质，这可能会引起枝角类营养摄取不足[26]。相关研究表明，在可食性绿藻食物投喂的条件下，也能缓解微囊藻对枝角类动物的毒害作用。与小球藻混合，单细胞有毒的铜绿微囊藻可被中华溞(Daphniasinensis)利用，改善其生活史特征[27-28]。这与本试验结果相一致。本试验中，在有毒铜绿微囊藻存在的条件下，小球藻所占的食物比重越高，蒙古裸腹溞存活时间越长，繁殖能力越好，由此更好地维持蒙古裸腹溞生命的活动。

内禀增长率是判断种群增长潜力的重要参数。在单一铜绿微囊藻的环境下，蒙古裸腹溞丧失繁殖能力，这也从侧面反映有毒铜绿微囊藻对蒙古裸腹溞的繁殖具有显著的负面影响。在其他食物条件下，蒙古裸腹溞首次产幼时间均一致，可能与设置食物密度较低有关。单一小球藻和小球藻占比高的处理组的内禀增长率高于其他组，表明蒙古裸腹溞在优质食物和优质食物占比高的条件下具有较高的种群增长潜力。相关研究发现，长期生长在微囊藻占优势的湖泊中的一些小型枝角类，对微囊藻具有较好的适应性，从而减弱了微囊藻对其毒害作用[29-30]。在本试验中，铜绿微囊藻密度占比高的处理组也有较好的内禀增长率，可能与蒙古裸腹溞在经受微囊藻毒素一段时间的干扰从而对毒素产生抗性有关。因此，可以推测蒙古裸腹溞在面对产毒蓝藻的胁迫时能产生快速适应的集中表现可能是生长和繁殖能力的提高。

3.3 有毒铜绿微囊藻对蒙古裸腹溞抗氧化酶的影响

在抗氧化酶中，去除活性氧的主要是过氧化氢酶，其通过去除过氧化氢减少组织损伤[34]。在试验中混合藻液可诱导活性氧的产生以及增强过氧化氢酶的清除能力，导致过氧化氢酶活性增加。过氧化氢酶活性在初期小球藻和有毒微囊藻混合液中显著增加，在后期缓慢下降。主要原因是绿藻中抗氧化剂类胡萝卜素增加了过氧化氢酶的活性[35]。后期酶活性下降是微囊藻的毒性作用增强所致，可能会降低过氧化氢酶去除活性氧的效率。

4 结 论

(1)通过室内模拟，证实有毒铜绿微囊藻在低盐度水生态系统对蒙古裸腹溞具有较强的毒害作用。表现在抑制蒙古裸腹溞生长繁殖，使其寿命减短且无繁殖情况。而蒙古裸腹溞作为盐水枝角类毒性测试的模式生物，进一步延伸到蓝藻暴发的阶段，预测微囊藻的毒性作用可能会对水域内浮游动物的生长繁殖产生不利影响。

(2)在两种食物条件下，添加小球藻，可以缓解铜绿微囊藻对蒙古裸腹溞的毒害作用，且随着有毒铜绿微囊藻占比的下降，净生殖率和世代时间显著上升，但内禀增长率差异不显著，这可能与蒙古裸腹溞对微囊藻毒素的抗性有关。

(3)通过对微囊藻毒素胁迫下的96 h蒙古裸腹溞的抗氧化酶效应的研究，与小球藻组相比，暴露在有毒铜绿微囊藻的蒙古裸腹溞的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性下降，铜绿微囊藻抑制其生长。