痛风的自发缓解与NETs

李志岭，张剑勇，贾二涛

(1.广州中医药大学 第四临床医学院，广东 深圳 518000；2.深圳市中医院，广东 深圳 518000)

急性痛风的发作有两个必要的条件，一个是单钠尿酸盐(MSU)沉积，二是机体对于晶体产生的炎症反应。尿酸从过饱和的关节液或血液中析出沉积于关节内，继而引发的一系列炎症反应[1]，临床往往表现为突发的、剧烈的疼痛、红肿。急性痛风症状多在1周左右不加干预便可自行消退，但是MSU却并没有消失。为什么炎症反应会在刺激因素仍然存在的情况下自行消退？有许多研究者尝试回答这个问题，目前有许多证据表明这种情况与中性粒细胞诱捕网(NETs)的形成是呈高相关性的。下面我们就痛风的自发缓解与NETs相关机制作一简要综述。

1 痛风的自发缓解

人们目前对于急性痛风自发缓解机制的了解十分有限，多数情况下痛风会急性发作，往往在1 d之内症状达到顶峰，但是即使不加任何药物干预，7～10 d左右症状也会缓解[2]。因此研究者们提出了多种假说，但仍没有形成一个被大多数研究者认可的共识。自发缓解涉及到的可能不是单一路径，而是多种机制共同作用，比如巨噬细胞、炎症因子及炎症小体负调控、细胞凋亡以及我们要重点论述的NETs[3]。

2 NETosis

2.1 中性粒细胞与NETosis

首先，MSU晶体激活炎症小体NALP3，并且巨噬细胞和肥大细胞先于中性粒细胞受到刺激，从而释放出炎症因子和组胺，使得中性粒细胞趋化聚集，大量的中性粒细胞能够清除引发炎症的异物。同时包括中性粒细胞在内的炎症细胞释放大量的炎症因子和趋化因子，激活更多的炎症细胞。为了阻断这种正反馈循坏，机体通过中性粒细胞凋亡的形式进行调控[4]。中性粒细胞是人含量最多的白细胞，聚集到炎症部位，经过染色质解缩和膜破裂或通过囊泡运输的方式，核酸物质和颗粒蛋白融合并释放到胞外而形成NETs，这个过程称为NETosis。目前已知的催化酶主要有蛋白精氨酸脱亚胺酶(PAD)4、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)和髓过氧化物酶(MPO)等[5]。

中性粒细胞受到各种刺激导致钙离子释放激活钙离子通道使Ca2+内流，在线粒体基质中累积的Ca2+激活了非选择性线粒体孔隙(MPTP)与线粒体活性氧物种(mtROS)的形成，mtROS在蛋白激酶C的参与下明显激活NADPH氧化酶[6]。活性氧(ROS)其中一个重要来源是由NADPH氧化酶产生的，ROS激活了PAD4，其在NETs形成过程中扮演了极其重要的角色。PAD属于Ca2+结合蛋白，其活性受到Ca2+的调控[6]。PAD4催化组蛋白的瓜氨酸化，减少组蛋白强正电荷，从而弱化了组蛋白与DNA的结合，核小体因此解聚[7-8]。随后NE从嗜天青颗粒释放转移到细胞核处，部分降解特定组蛋白连接物H1，并且修饰了组蛋白核心。随后MPO很可能是通过次氯酸盐的合成机制，二者通过共同作用使染色质进一步解聚[9-10]。解聚后DNA与瓜氨酸化的组蛋白及相关酶形成NETs排出到细胞外，从而发挥功能。凋亡的中性粒细胞很可能通过允许趋化因子受体(CCR)5的过度表达吸附趋化因子配体(CCL)3和CCL5，使其远离目标而减弱趋化因子信号[11]。

此外，还有一种不依赖于ROS的NETs形成路径，中性粒细胞受到刺激后同样经过染色质解聚，与相关的酶通过囊泡的方式释放到胞外，而残存有少量细胞核的中性粒细胞仍具备一定迁移、吞噬的活性[12]。MSU晶体刺激形成NETs的过程是否依赖ROS仍存在争议，有的实验甚至得出了相反的结论[13-14]。

2.2 MiRNA与NETosis

NETs是以DNA为骨架的网状结构，已有实验证实NETs会携带一些RNA，并且多项研究证明了miRNA在NETs形成过程中的重要调节作用。

miRNA142-3p通过调控PKC通路影响巨噬细胞的极化、炎症因子的产生等功能，进而与NETs相互作用[15]。研究者在miR-146a对NETs的调节的研究上得出了不完全一致的结果，但两个阳性结果至少说明了miR-146a对NETs是有调节作用的[16-18]。miR-155与miR-146a类似正负反馈的模式调节NF-κB的活性，进而实现对炎症的控制。miR-155通过3′-UTR区域富AU元件来调控PAD4mRNA，从而调控NETs的形成[18-20]。

还有一些潜在的miRNA可能与NETs的形成相关，比如miR-505下调参与ROS产生的一种线粒体蛋白SIRT3，并实验观察到了较高的NETs[21]。miR-15b-5p和miR-378a-3p通过抑制Akt/mTOR途径的活性，从而激活机制促进NETs的形成[22]。

3 NETs与痛风炎症消退的机制

3.1 aggNETs

必须说明，NETs在整个炎症过程中并非只参与了炎症消退的过程，而是非常奇特地表现为促炎与抗炎两种功能，这种看似矛盾的功能形成的重要原因便是NETs的密度[23]。Schauer等[24]对比野生鼠和NETosis机制缺陷Ncf1**小鼠足趾垫注射MSU晶体后足趾炎症反应，即野生型小鼠出现与人类似的痛风自限过程，而NETosis基因缺陷Ncf1**小鼠相对迟缓，而且炎症因子水平更高，关节炎症更重且呈现慢性化。在腹腔注射MSU晶体后，野生小鼠同时注射可分解aggNETs的脱氧核糖核酸酶Ⅰ，发现其炎症反应与基因缺陷小鼠是相似的。同样的，基因缺陷小鼠在MSU诱导后经由过继转移aggNETs来改善炎症。NETs可以释放白细胞介素(IL)-8，即趋化因子，用以招募中性粒细胞，当中性粒细胞达到一定浓度时，NETs相互聚集便形成了aggNETs。有实验就已经观察到，aggNETs外附着的丝氨酸蛋白酶能够通过降解炎症因子如IL-1β和趋化因子，以此来阻断中性粒细胞趋化和促使炎症的消退[23]。

在炎症早期NETs密度较低，内源性大分子抗蛋白酶非常容易达到细胞网与相应的中性粒细胞丝氨酸蛋白酶(NSPs)结合，这使得NSPs难以发挥对细胞因子和趋化因子的水解作用。但是，aggNETs是一种高密度、更大面积的NETs聚集体，它的结构更加紧密。在炎症区域与健康组织之间形成屏障，防止了炎症的蔓延[25]。并且aggNETs能够有效地阻挡大分子物质的进入，而像炎症因子和趋化因子这种小分子蛋白仍然可以进入。没有了抗蛋白酶的抑制，NSPs能够非常高效地水解促炎因子，阻断了中性粒细胞聚集和激活的循环，从而使炎症消退[26]。不同诱因诱导的aggNETs在炎症因子降解能力上是不存在差异的[27]。

3.2 NETs的平衡

由于NETs的成分及结构的特性使其具有抗原性，这意味着NETs与炎症的持续状态，尤其是自身免疫性炎症疾病是呈相关性的。因此，维持NETs含量的平衡对于炎症反应来说也是至关重要的[26]。其中NETs的原料——中性粒细胞的凋亡，对维持NETs平衡有着重要的意义[28]。

3.2.1 巨噬细胞吞噬 炎症反应中巨噬细胞的作用同样不容忽视，聚集的巨噬细胞可以清除细胞碎片及异物，已有研究者注意到巨噬细胞与NETs之间的相互作用。有研究发现，小鼠体内MSU晶体刺激下巨噬细胞发生极化，使得具有抗炎作用的酶-血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)合成和分泌增多[29]，并且导致上调了CIS(SOCS蛋白家族)和SOCS3表达，进而降低了IL-1β和肿瘤坏死因子α。激活了转化生长因子(TGFβ1-)启动子，TGF-β1是非常重要的限制炎症因子，巨噬细胞快速清除凋亡的中性粒细胞也可以促进TGF-β1的分泌。短蛋白吡咯结构域和含caspase结构域能够干扰凋亡相关斑点样蛋白ASC对脂多糖的反应，调节炎症小体的激活。在人类体外实验中，损伤相关分子模式(DAMPs)诱导的TLR信号的负调控因子可以关闭无菌炎症的因素[3]。在TGF-β1的相关作用下，具有抗炎作用的M2型巨噬细胞表现了更高的吞噬能力，而人类巨噬细胞能够吞噬中性粒细胞及NETs。巨噬细胞分泌的很多介质均已被证明能够促使NETs的形成，已经有研究者观测到了巨噬细胞吞噬NETs的现象，这个过程是通过DNase Ⅰ对NETs的胞外预处理以及NETs与C1q的调理来促进的，并且这个过程保持了免疫沉默[30-31]，也就是说巨噬细胞同样参与到了NETs抗炎过程，而且维持NETs水平的动态平衡。

3.2.2 中性粒细胞凋亡 中性粒细胞坏死性凋亡(necroptosis)是一种受调控的程序性细胞死亡，我们对它的了解远不如细胞凋亡。有研究表明,在MSU的刺激下通过激活NADPH氧化酶复合物的组装和活性与ROS的产生，进而影响NETs的形成。之后的实验表明，至少坏死性凋亡与NETosis是呈相关性的。与坏死性凋亡不同，细胞凋亡为了限制有害中性粒细胞的释放，保持了细胞膜的完整，并暴露膜上的磷脂酰丝氨酸残基，以便巨噬细胞的识别与吞噬。并且凋亡的中性粒细胞还刺激了巨噬细胞产生抗炎因子IL-10和TGF-β1[28]。此外，还有研究发现膜联蛋白A1(AnxA1)能够调节中性粒细胞在关节中的募集，通过诱导中性粒细胞凋亡和清除而减轻痛风的炎症反应。并且发现用AnxA1活性N端肽预处理小鼠可减少关节周围中性粒细胞内流以及IL-1β、CCL1的产生[32]。ω-3脂肪酸是必需脂肪酸，能够通过G蛋白偶联受体GPR40和GPR120特异性地，至少部分性抑制NLRP3炎症小体激活以及抑制高脂饮食诱导的NLRP3炎症小体的激活，并且能够限制中性粒细胞趋化进而诱导炎症的消退。还有研究[33]证明，短链脂肪酸能够诱导中性粒细胞凋亡从而缓解炎症。

4 中性粒细胞微囊泡与NETs和炎症消退

微囊泡(microvesicles，MVs)参与细胞间的信号转导与功能调控，因而在生理及病理状态下均可产生[34-36]。中性粒细胞衍生的微囊泡(NDMVs)被认为是位于炎症局部的中性粒细胞通过膜的起泡和脱落产生的。有研究[37]发现瓜氨酸组蛋白H3(H3Cit)与MVs之间结合，能够延长H3Cit的寿命，也就是说MVs可能是与NETs结合并且对NETs起到了一定的保护作用。

NDMVs能够通过抑制自然杀伤细胞、巨噬细胞、软骨细胞等炎症基因表达发挥抗炎功能。此外，还有研究者在小鼠实验中发现NDMVs增加软骨细胞产生TGF-β来减少炎症关节炎软骨损伤[38]。有实验发现MVs能够下调巨噬细胞的细胞活性，通过在早期阶段抑制C5a介导的NLRP3炎症小体相关的IL-1β的释放以及通过诱导巨噬细胞分泌TGF-β1起到抗炎作用[11,39]。

中性粒细胞衍生痕迹(NDTRs)是近年来发现的与NDMVs功能不同的胞外小泡。与抑制炎症不同的是，NDTRs有更高的促炎miRNAs的表达，并且诱导巨噬细胞向促炎表型即M1型级化。NDTRs的产生很可能是炎症过程中非特异性的，虽然NDTRs具有促炎作用，但是却降低了脓毒症小鼠的致死率和慢性结肠炎小鼠模型的病理改变。适度的炎症反应是机体的自我保护机制，并非是绝对有害的，NDTRs就是在早期中性粒细胞迁移到炎症过程中产生的促炎因素，NDMVs则抑制过度炎症，减少对机体的损害。因此，无论NDTRs还是NDMVs可能都是对机体的一种保护机制[38,40]。

5 小 结

对急性痛风的自然消退机制的探索至今仍处于初级阶段，根据目前掌握的科研证据，这个过程是涉及多方面的。NETs无疑是其中重要的环节，中性粒细胞受到各种炎症因子和趋化因子的作用而聚集于关节囊内的MSU晶体沉积部位，并且受到酶的剪切等作用而程序性死亡，最终形成NETs，并且随着炎症反应的进行，NETs逐渐聚集而形成aggNETs，从而发挥抗炎作用，无论是对无菌性炎症如痛风，亦或是感染性疾病都发挥了一定的积极作用，值得我们关注[41]。生命体是非常精密的、智能的，懂得矫枉而不过正，因此作者还综述了机体维持NETs含量平衡的机制，包括可能有延长NETs生存长度作用的MVs，这也是多种机制中不可或缺的一环，应当引起我们的重视。