DJ-1在前列腺癌组织中表达及对LNCaP细胞增殖、侵袭能力的影响

韦高猛 黄勇平 刘王睿 唐毓金

(右江民族医学院 1附属医院泌尿外科，广西 百色 533000；2研究生院；3骨科)

前列腺癌(PCa) 是欧美发达国家男性最常见的恶性肿瘤，其发生率位居第一位，死亡率仅次于肺癌，居于第二位〔1〕。近年来，随着我国人口老龄化的加重及饮食习惯改变等原因，PCa的发病率及死亡率逐年增高〔2〕。而且相当一部分PCa患者发现时已属于晚期，失去了根治性手术治疗的机会〔3〕。前列腺特异性抗原(PSA)是PCa早期筛查最主要的标志物，其也普遍作为PCa的分期、预后和监测指标〔4〕，但是随着研究的不断深入，PSA被认为仅对前列腺组织特异，而不是对PCa组织特异，PSA 升高不一定考虑PCa，许多良性前列腺增生(BPH)、前列腺炎、留置尿管及肛门指诊等患者都表现出PSA升高，导致相当比例不必要的穿刺活检，加重了患者的经济负担并造成极大痛苦〔5〕。

DJ-1又称PARK7，具有促进癌细胞增殖、转移，并抑制细胞凋亡、抗氧化等多种功能。近期多项研究表明，DJ-1蛋白通过激素受体信号的调节、氧化应激及细胞增殖、凋亡的调节来参与机体恶性肿瘤的发生、发展及预后〔6〕。DJ-1可通过抑制p53-B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)凋亡途径避免紫外线诱导肿瘤细胞凋亡〔7〕。DJ-1还可以通过调节p53-蛋白激酶B(Akt)通路来参与肿瘤细胞的形成与发展〔8〕。另外，DJ-1还可通过负性调节抗肿瘤抑癌基因磷酸酶基因(PTEN)来实现肿瘤的形成与发展〔9〕，如通过 PTEN/PI3K/Akt途径抑制肺癌、肝癌细胞的凋亡，并参与肺癌、肝癌细胞的增殖与转移〔10,11〕。目前关于DJ-1基因在PCa中作用的研究较少，其分子机制也尚未明确。本研究通过检测 DJ-1在PCa组织和PCa细胞系的表达情况，探究其在PCa的进展及预后中的临床意义，通过沉默DJ-1表达探究其对PCa细胞的增殖及侵袭的影响。

1 资料和方法

1.1资料来源 收集2015年1月至2018年12月间在右江民族医学院附属医院泌尿外科诊疗的50例BPH和51例PCa组织标本。PCa患者纳入标准：(1)患者组织均经病理证实；(2)单一PCa未合并其他肿瘤的患者；(3)标本由前列腺穿刺活检术、前列腺电切术或PCa根治术中获得，术前患者均未接受内分泌治疗、化疗或者放疗；(4)术后定期随访时间半年以上。PCa组年龄50～84岁，平均66.3岁；Gleason评分≤6分20例，Gleason评分为7分16例，Gleason评分≥8分15例。PCa患者纳入标准：(1)患者组织均经病理证实；(2)不合并其他恶性肿瘤患者。BPH组年龄53～83岁，平均65.2岁；与PCa患者年龄相匹配。

1.2诊断与治疗 51例PCa患者术前均给予前列腺活检、影像学检查〔B超、CT、磁共振成像(MRI)〕，确定肿瘤位置、直径、数目、有无淋巴转移及有无骨转移等；抽血检查PSA确定数值，用Gleason评分进行分级，并采用AJCC第8版的TNM分期系统。且患者均经PCa根治术或去势等进行进一步治疗。

1.3细胞系 LNCaP细胞：购自于上海生命科学研究院细胞所。

1.4主要试剂 siRNA-NC、DJ-1-siRNA(Shanghai Genechem Co.,Ltd公司)；Lipofectamine2000 转染试剂(美国Gibco公司产品)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(鼎国)；彩色预染蛋白分子量标准(10～170 kD，Thermo)；ECL化学发光试剂盒(GENVIEW)；兔源DJ-1多克隆抗体(KPL)；免疫组化试剂盒(Affinity)。Transwell小室(Corning公司)，CCK8试剂盒(福州迈新)。

1.5方法

1.5.1免疫组化(SP)法检测DJ-1在PHD及PCa组织中的表达 将组织切成厚度约为5组织的切片，常规脱蜡、水化，过氧化氢溶液浸泡灭活内源性的过氧化氢酶，用0.01 mol/L的枸橼酸钠缓冲液进行微波修复，Ⅰ抗封闭，Ⅱ抗孵育，滴加二甲基联苯胺(DAB)显色液，自来水冲洗并用苏木素复染，脱水、透明、树胶封片，最后进行镜检。病理切片分别由2位高年资病理医师进行判断，最后将结果汇总。分别在每张玻片上随机选择5个高倍镜视野，细胞内出现棕黄色颗粒的可判定为阳性表达。根据细胞染色的强弱程度评分可分为0～3分:其中0分为胞质黄色颗粒;1分为高于背景和阴性对照的淡棕黄色颗粒;2分为介于强弱之间且染色清晰的棕黄色颗粒;3分的为阳性染色强并有大量深棕色颗粒。根据阳性细胞百分比评分可分为0～4分:0%评为0分，1%～25%评为1分，26%～50%评为2分，51%～75%评为3分，>75%评为4分。阳性细胞染色百分比×染色强度=免疫反应性评分(IRS)〔12〕。

1.5.2生物信息学分析 本研究纳入癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)计划数据库中492例PCa患者和152例配对癌旁正常组织，通过Studentt检验分析DJ-1转录组水平的表达差异。通过R软件分析和预测DJ-1相关的蛋白-蛋白互作网络(PPI)、细胞外RNA调控网络及转录因子调控网络。

1.5.3LNCaP细胞培养及细胞转染 PCa LNCaP细胞株分别置于含10%胎牛血清、5 U/L青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI1640培养液中进行培养，培养环境条件为恒温培养箱中5% CO2、37℃及饱和湿度。将LNCaP细胞传代到6孔板，密度为20%。对传代细胞分为空白对照(CON)组、LNCaP-NC(NC)组、LNCaP-siRNA(KD)组。CON组：不予感染慢病毒；NC组：用阴性对照慢病毒感染；KD组用LNCaP-siRNA重组慢病毒感染。将加入病毒的细胞移入指定的培养箱继续进行培养3 d，在倒置荧光显微镜下观察感染效率并拍照。

1.5.4RT-qPCR检测DJ-1的mRNA在各组细胞中的表达水平 采用Trizol法分别提取总RNA并置于-80℃下保存，使用核酸蛋白检测仪分别检测RNA的浓度及纯度。以RNA为模板进行逆转录，逆转录条件为42℃ 60 min 72℃ 10 min，生成的cDNA立刻进行Real-time PCR 扩增。以 GAPDH 作为内参照，DJ-1扩增引物序列：上游引物 ：5′-CCGTGATGTGGTCATTTGTC-3′；下游：5′-TTCATGAGCCAACAGAGCAG-3′。内参基因β内Actin上游引物：5′-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3′；下游：5′-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3′。PCR条件：95℃ 3 min；95℃ 15 s；59℃ 20 s；72℃ 30 s，共40个循环。

1.5.5Western印迹法检测DJ-1蛋白在各组细胞中的表达水平 根据细胞量的多少，每管细胞加100～500 μl含苯甲基磺酰氟(PMSF)的可溶性蛋白裂解液(RIPA)裂解液，于冰上裂解30 min，在4℃下12 000 r/min离心10 min后用BCA法检测蛋白浓度。进行电泳并转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜后用5%脱脂奶粉溶液封闭。4℃下Ⅰ抗(DJ-1 兔抗人多克隆抗体及内参照GAPDH抗体)孵育过夜，次日取出PVDF膜，PBS洗膜5次后二抗室温孵育1 h，再洗膜5次后显影，用图像分析软件Image J对图像进行灰度分析。

1.5.6CCK-8技术分析转染后对LNCaP细胞增殖的影响 在96孔板中设立CON、NC、KD 3组，向每板孔中种入细胞悬液，密度为5 000个细胞/孔；置于培养箱中预培养24 h；各组细胞在检测时间点时，滴加CCK-8溶液，再将细胞放置培养箱内培育3 h。置于酶联免疫监测仪上测定各孔吸光度值，选择450 nm波长，并记录结果。

1.5.7平板克隆形成实验分析转染后对LNCaP细胞增殖的影响 将转染好的细胞用0.25%胰酶消化后，按照密度为500个细胞/孔种到6孔板中，3～4 w后终止培养，并弃去培养基，用4%的甲醛固定15 min，添加适量结晶紫染色液染色10～30 min，洗除染色液后室温干燥并拍照、计数。

1.5.8细胞划痕实验分析转染后对LNCaP细胞迁移的影响 收集各组对数生长期细胞，将生长状态良好的细胞接种到6孔培养板上，置于培养箱内继续培养24 h。显微镜下观察见细胞铺满单层后，用200 μl的枪头轻轻划痕，每孔划3～5道；吸出培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)清除细胞碎片，再次加入培养基并拍照，此时记时为0 h；培养48 h后再次取点拍照，并计算细胞间距离的均值。

1.5.9Transwell实验分析转染后对LNCaP细胞侵袭的影响 准备好将Transwell插入物放入24孔板中以进行浸润性检查。将各组细胞接种在无血清培养基中，然后接种在每个Transwell室中。随后，在24孔板腔中添加含有20%胎牛血清的培养基。37℃恒温培养箱中培养24 h后，将底部的细胞用4%的聚甲醛固定15 min，擦除上腔室中的细胞，用PBS洗涤，然后将细胞用结晶紫染料染色，风干后用显微镜拍摄LNCaP细胞，并计数。

1.6统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验、单方差分析、χ2检验。

2 结 果

2.1DJ-1在BPH及PCa标本中的表达差异 DJ-1主要表达在细胞质中，DJ-1在BPH组织呈阴性表达，在前列腺癌旁组织中低表达或阴性，而在前列腺癌组织中的表达水平较高，显示为棕黄色颗粒(图1)。BPH-1组IRS为2.2±0.57，PCa组IRS为3.7±0.51，其差异有统计学意义(P<0.05)。Gleason评分≥8分的15例患者IRS的平均值为7.9±0.9，Gleason评分=7分的16例患者IRS平均值为4.7±0.6，Gleason评分≤6分的20例患者IRS平均值为2.7±0.6，存在显著性差异(P<0.05)。

2.2PCa中DJ-1蛋白表达与AHYMUM临床病理特征的关系 DJ-1蛋白在前列腺癌Ⅲ～Ⅳ期患者中的表达明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者，在Gleason 评分≥7患者中的表达显著高于Gleason 评分<7分患者，在总PSA值≥20 ng/ml患者中表达显著高于总PSA值<20 ng/ml患者，在转移灶数≥4个患者中表达显著高于转移灶数<4个患者中的表达(P<0.05)。见表1。

表1 DJ-1表达水平与AHYMUM临床病理特征的相关性

2.3生物信息学预测 PCa组织中DJ-1 mRNA表达量(8.690±0.324)显著高于癌旁正常组织(8.175±0.474，P<0.001)，而DJ-1的甲基化修饰水平(中位数0.035)显著低于癌旁正常组织(中位数0.039，P<0.05)，可能作为后续研究的切入点。此外，我们通过生物信息学方法预测到DJ-1的PPI，DJ-1可能与PCa相关的关键基因密切相关，如：雄激素受体(AR)，抑癌基因第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)，氧调节的关键基因希佩尔-林道基因(VKL)等。并预测到DJ-1相关的以DNA结合方式的转录因子调控、转录因子激活、相关lncRNA、靶向的miRNA等，为后续机制研究奠定基础。见图2。

2.4DJ-1表达与PCa患者生化复发的关系 对51例PCa患者进行随访，血清 PSA 水平连续两次≥0.2 ng/ml被认定为生化复发，高表达患者26例，低表达患者25例。表明DJ-1高表达与PCa患者生化复发显著相关(HR=2.4，P=0.032)。见图3。总生存期由于随访时间较短未获得。

2.5DJ-1 siRNA重组慢病毒转染LNCaP细胞获得高转染效率 经过慢病毒感染后，将细胞置于倒置相差显微镜下观察转染情况。NC组、KD组在感染24 h后，可见到部分细胞内出现荧光，细胞融合率为60%～70%，生长状态良好。3 d后再次显微镜下观察，可见细胞融合率为80%～90%，生长状态良好，细胞数达到实验要求(约1×106个/孔)，荧光亮度强且范围最大，感染效率达80%以上。见图4。

2.6Western印迹和RT-qPCR检测沉默DJ-1基因后LNCaP细胞DJ-1蛋白表达水平 CON组(0.42±0.12，1.01±0.12)与NC组DJ-1蛋白及mRNA表达水平(0.41±0.11，1.03±0.07)比较，无明显差异(P>0.05)。KD组中DJ-1蛋白及mRNA表达水平(0.09±0.07，0.26±0.14)均明显低于NC组(P<0.01)。见图5。

2.7沉默DJ-1基因后对PCa LNCaP细胞的增殖和克隆形成的影响 CCK-8实验显示 DJ-1基因沉默后，相对于NC组和CON组，KD组PCa INCaP细胞增长速度明显降低(P<0.01)。与此同时，平板克隆形成实验显示，DJ-1的沉默抑制PCa LNCaP细胞的增殖和克隆形成(P<0.05) 。见表2、图6。

2.8沉默DJ-1基因后对PCa LNCaP细胞的侵袭和迁移的影响 KD组侵袭细胞数明显低于CON组和NC组(P<0.01)，而CON组和NC组的差异无统计学意义(P>0.05)。KD组细胞划痕愈合相较于CON和NC组显著减慢；细胞的迁移能力受到抑制(P<0.001)。见表2、图7、图8。

3 讨 论

随着我国人口老龄化的加速、生活环境的改变和饮食结构等因素的改变，PCa的发病率和死亡率迅速增长，其增长率已经居于肿瘤之首位，有可能超过膀胱癌成为泌尿系统最常见肿瘤〔13〕。PCa的早期症状并不明显，因而大部分患者就诊时往往已处于中、晚期，失去了根治手术的最佳时机，所以了解PCa的发生和发展的潜在机制，有利于早期诊断，愈后评估和选择针对性的治疗策略。

DJ-1是Nagakubo等〔14〕近年来发现的一种新的丝裂原依赖性癌基因。有学者对2 000名受试者进行研究发现，相比于非癌症患者，DJ-1在癌症患者中高表达，且高表达的DJ-1与癌症的转移，分化程度及淋巴结转移密切相关〔15〕。Qiu等〔16〕研究表明DJ-1在肝癌组织中高表达，并且表达水平与总生存期负相关性。Kawate等〔17〕发现，乳腺癌患者DJ-1的表达水平与患者的肿瘤分级密切相关，分级越高，DJ-1的表达水平越高，DJ-1可能是乳腺癌的候选血清标记物。Zheng等〔18〕经研究后发现，DJ-1在结肠癌组织中高表达，且与肿瘤大小和临床分期有关，进一步研究后发现DJ-1表达与PI3K-p110α、p-AKT、HIF-1α表达呈正相关，认为DJ-1通过调节PI3K-AKT-HIF-1α通路介导结肠癌细胞存活。DJ-1高表达还可通过PTEN-AKT通路促进结肠癌细胞的生长与侵袭〔19〕。本研究结果说明DJ-1与PCa的发生、发展、侵袭、转移及预后密切相关，这和DJ-1在人体其他类型肿瘤中的表达相一致。

本研究结果均提示沉默DJ-1基因表达可有效抑制PCa LNCaP细胞的增殖。沉默DJ-1后LNCaP细胞的增殖受到抑制的具体机制目前尚不明确，可能与下列机制有关：LNCaP细胞对AR高度依赖性〔20〕，通过基因组编辑衍生的AR和AR敲除后可以使LNCaP细胞克隆表现出明显不同的生物学特性和致瘤特性〔21〕，DJ-1在细胞氧化还原稳态中起关键作用，是AR依赖转录的正调控因子〔22〕。DJ-1蛋白可在Nrf2驱动的抗氧化保护中起到正性调控的作用，DJ-1的下调可使Nrf2活性降低，进而弱化AR的转活化，抑制LNCaP 细胞增殖〔23,24〕。DJ-1还可通过抑制VHL介导的低氧诱导因子(HIF)2α泛素化，进而改变AR信号，引起PCa细胞的增殖、转移〔25〕。Qin等〔26〕最新研究结果显示，沉默DJ-1表达可增强JNK和Bcl2的磷酸化，并增强自噬效应蛋白(Beclin)1和B细胞淋巴瘤(Bcl)2的解离，通过JNK-Bcl2-Beclin1信号通路降低AR活性，抑制前列腺癌LNCaP细胞的增殖。

本研究结果均提示沉默DJ-1基因表达能显著抑制前列腺癌LNCaP细胞的侵袭和迁移能力。研究表明，降低DJ-1表达可增加PTEN表达活性，抑制Akt的活化，从而减弱上皮-间质转化 (EMT)活性，肿瘤细胞的侵袭、迁移被抑制〔27,28〕。Qiu等〔29〕发现DJ-1的下调使PTEN表达水平显著上调，并通过PTEN/PI3K/Akt信号通路抑制甲状腺癌K1、TPC-1细胞的增殖、迁移和侵袭。在胰腺癌中，通过抑制DJ-1的表达，可上调抑癌基因PTEN水平，影响PTEN-PI3K/Akt通路的活性，进而抑制胰腺癌细胞增殖、迁移，诱导细胞凋亡，并可降低胰腺癌细胞对化疗药物的耐药性〔30,31〕。另外，通过沉默DJ-1表达可上调p53及其下游凋亡蛋白Bax的表达水平,下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平，从而使EMT活性降低〔32〕。当DJ-1表达水平降低时使p53活性增强，恢复了细胞周期阻滞功能，上调下游的bax-caspase通路，并抑制Akt途径活性，从而使卵巢癌细胞的侵袭、迁移能力明显减弱。DJ-1的过表达还可直接激活Akt通路，进而上调MMP-2和MMP-9的表达，增强胃癌细胞SGC7901的体外侵袭、迁移和体内腹膜转移能力〔33〕。本研究与上述实验结果一致。表明DJ-1对前列腺癌LNCaP细胞的侵袭转移能力密切相关，具体调控机制仍需进一步研究。