达格列净对糖尿病大鼠肺纤维化治疗作用机制及效果

周蕾 房辉 张守军 张雅中 李冰

(唐山市工人医院 1内分泌二科，河北 唐山 063000；2急诊科)

糖尿病是以葡萄糖代谢紊乱、血糖水平升高为 特征的内分泌系统疾病。长期高血糖可引起肾、眼、心脏的慢性病变。肺毛细血管丰富，血容量较大，是糖尿病的重要靶器官，研究表明糖尿病可引起肺部纤维化〔1,2〕。在慢性高血糖状态下，细胞外基质的沉积导致肺纤维化，继而发生阻塞性及限制性通气功能障碍〔3〕。本研究通过建立糖尿病大鼠模型，观察转化生长因子(TGF)-β1/p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导通路在糖尿病大鼠肺组织表达及达格列净的干预作用，探讨达格列净通过调控TGF-β1/p38MAPK信号传导通路影响糖尿病肺纤维化的发生与发展。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 选取8周龄左右清洁级健康SPF级SD雄性大鼠40只，体重220～260 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。所有大鼠置于通风良好，相对湿度45%～55%，温度为18～22℃的清洁动物房内，自由饮食取水，并及时更换饲料。适应性饲养1 w后用于实验。

1.1.2主要实验试剂及仪器 达格列净(阿斯利康制药有限公司)，链脲佐菌素(STZ，美国 Sigma公司)，兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体、兔抗大鼠p38MAPK多克隆抗体、兔抗大鼠纤维连接蛋白(FN)多克隆抗体(英国Abcam公司)，山羊抗鼠 IgG 二抗(R&D 公司)，二氨基联苯胺(DAB)、免疫细胞化学法(SABC)试剂盒(美国 Pierce 公司)，β-actin(批号:CP10399，美国 Abnova 公司)，二喹啉甲酸(BCA) 试剂盒(上海生工生物工程有限公司)，逆转录试剂盒(日本 TaKaRa 公司)，血糖仪及血糖检测试纸条(德国罗氏公司)。

1.2方法

1.2.1动物分组与处理 将40只SD大鼠随机分为A、B、C、D组，每组各10只，A组为对照组，B组为糖尿病组，C组为达格列净治疗4 w组，D组为达格列净治疗8 w组。除A组给予普通颗粒饲料外，其余3 组均给予高糖高脂饲料，喂养4 w后，禁食 12 h 后腹腔注射 STZ 60 mg/kg，72 h后尾静脉采血测定空腹血糖(FPG)≥16.7 mmol/L 为模型复制成功。A组腹腔注射等量上述枸橼酸缓冲液。C组、D组分别给予达格列净达1 mg/kg，每天1次喂养，治疗时间分别为4、8 w，A、B组予等体积生理盐水喂养8 w。

1.2.2标本收集与处理 末次给药禁食12 h后，取大鼠尾末梢毛细血管全血测定FPG。杀检前1 d空腹尾静脉取血测定FPG、糖化血红蛋白(HbA1c)及体重(BW)。大鼠HbA1c测定试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。大鼠于麻醉状态下腹主动脉取血，ELISA试剂盒于30 min内进行动脉血气分析：氧分压(PaO2)、氧饱和度(SaO2)、二氧化碳分压(PaCO2)。用电子天平称量并记重量。留取各组大鼠肺组织标记后放置-80℃保存。

1.2.3免疫组织化学(SP)染色 按照SP试剂盒说明书检测各组TGF-β1、p38MAPK、FN蛋白表达情况。用病理图像分析系统 Image-Pro Plus6.0 进行免疫组化图像分析,阳性表达是呈棕黄色颗粒。

1.2.4Western印迹 取出保存的肺脏组织，加入蛋白裂解液裂解肺组织，提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，取出20 μg 统一上样进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，凝胶移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜行转膜反应后加入封闭液，清洗之后添加一抗，4℃过夜孵育，添加二抗，随后电化学发光(ECL)显色，置于凝胶成像仪中观察TGF-β1、p38MAPK 、FN蛋白表达情况。

1.2.5RT-聚合酶链反应(PCR)检测NF-κB mRNA的表达 取新鲜冰冻组织约100 mg，按照Trizol一步法提取RNA,取等量RNA按逆转录试剂盒进行逆转录得到cDNA，取扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶电泳上进行电泳。以β-actin光密度值进行标准校正计算PCR产物相对含量。PCR 引物 用 Primer3在线引物设计软件设计，PCR引物由上海生物工程有限公司合成，β-catenin正义链：5′-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3′,反义链：5′-CACCAGAC-AGCACTGTGTTG-3′;核转录因子(NF)-κB：正义链：5′-TGTGGTGGAGGACTTGCTGAGG-3′,反义链：5′-AGTGCTGCCTTGCTGTTCTTGAG-3′。退火温度分别为58℃、61℃。

1.3统计学方法 采用SPSS19.0软件进行方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组FPG、HbA1c、BW、PaO2、SaO2、PaCO2水平比较 与A组比较，B组FPG、HbA1c、PaCO2水平均显著升高，BW、PaO2、SaO2水平均显著降低(均P<0.05)；与B组比较，C组和D组FPG、HbA1c、PaCO2水平均显著降低，BW、PaO2、SaO2水平均显著升高(均P<0.05)。C组和D组上述指标水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2肺组织病理学变化 与A组比较，B组肺组织结构紊乱，胶原纤维组织增生、变厚，肺泡间质及毛细血管基底膜变厚，部分肺泡腔塌陷及萎缩。与B组比较，C组和D组肺组织结构紊乱程度较前好转，肺泡间质及毛细血管基底膜较前变薄，肺泡腔萎缩甚至塌陷程度较前有所恢复。且D组较C组更明显。见图1。

2.3各组TGF-β1 p38MAPK、FN水平比较 免疫组化示B组肺组织中，TGF-β1、p38MAPK、FN呈间断不连续分布表达于肺间质及血管上皮细胞核周围的胞质，着色较A组明显加深，呈强阳性表达(P<0.01)。与B组比较，C组及D组着色相对较浅，且D组更为明显。见图2。免疫组化及Western印迹结果显示：与A组比较，B组TGF-β1、p38MAPK、FN水平均显著升高(均P<0.05)；与B组比较，C组和D组TGF-β1、p38MAPK、FN水平均显著降低，且D组更显著(均P<0.05)。见表2、表3、图3。

表2 免疫组化检测各组TGF-β1、p38MAPK 、FN的表达

表3 Western印迹检测各组TGF-β1、p38MAPK、FN的表达

2.4各组肺组织中NF-κB mRNA比较 与A组(0.68±0.04)比较，B组NF-κB mRNA水平(2.12±0.02,P<0.05)显著升高；与B组比较，C组和D组NF-κB mRNA水平(1.69±0.22，0.91±0.18)均显著降低，且D组更显著(均P<0.05)。见图4。

3 讨 论

糖尿病并发症严重影响患者的生活质量，而长期的高血糖又可导致机体微炎性反应加剧，损害肺功能〔4,5〕。Kopf等〔6〕研究指出，糖尿病前期及糖尿病患者中限制性通气功能障碍者所占比例较高，主要表现为肺通气功能障碍、小气道功能障碍及弥散功能障碍，且肺弥散功能下降与全身微血管病变相一致〔7〕。研究表明TGF-β1/p38MAPK参与组织纤维化的发生与发展〔8,9〕。TGF-β1被认为是促纤维化形成的重要细胞因子〔10〕。TGF-β1可由所有类型的细胞及浸润的炎性细胞分泌，反过来也参与纤维化的各个环节，包括刺激细胞外基质合成、抑制细胞外基质降解；刺激上皮细胞转化为肌纤维细胞，促细胞与基质黏附增强，促细胞外基质沉积〔11〕。FN是细胞外基质的重要成分，其含量增多是肺纤维化进展的重要指标。TGF-β1可特异性磷酸化和激活 p38MAPK信号通路，促进细胞增殖和迁移，p38MAPK在肺纤维化成纤维细胞中过度激活，使细胞胶原合成增加，最终导致肺纤维化〔12,13〕。NF-κB是p38MAPK下游信号分子，包括p65、 c-ReI、ReIB、p50和p52 5种亚型，各亚型之间相互组合形成二聚体〔14〕。NF-κB作为p38MAPK 下游信号分子，p38MAPK 活化后能激活 NF-κB 信号通路，促使 NF-κB 进入细胞核调控下游靶基因发挥作用〔15〕。

本研究通过基因和蛋白水平验证，糖尿病大鼠肺组织TGF-β1、FN水平明显增加，肺组织发生纤维化。其机制可能与TGF-β1/p38MAPK信号通路的活化相关。糖尿病大鼠肺组织p38MAPK、NF-κB表达升高，提示TGF-β1/p38MAPK信号传导通路活化增加，上调了NF-κB，增加了糖尿病大鼠肺纤维化的发生和发展。而经过达格列净治疗后，特别是在血糖不在继续下降的情况下，TGF-β1、FN表达量仍较前下降，考虑抑制了TGF-β1/p38MAPK信号通路，下调了NF-κB的表达。综上，TGF-β1/p38MAPK信号传导通路可能是导致糖尿病大鼠肺损伤的重要途径之一。达格列净其效应机制可能是抑制了TGF-β1/p38MAPK 信号通路的活化，发挥了抗纤维化的作用。

糖尿病患者血糖及并发症的控制有效改善糖尿病患者生活质量。笔者推测，达格列净改善糖尿病肺纤维化的作用可能是多靶点的，通过调控 TGF-β1/p38MAPK 通路活性来减少细胞外基质的沉积，抑制肺组织发生纤维化来发挥肺组织保护作用。综上，达格列净预防和治疗糖尿病肺纤维化可能将是今后临床研究的一个重要方向。在糖尿病并发症的治疗和预防方面，TGF-β1/p38MAPK信号通路可能也可作为特异性的干预靶点。