宁肺活血利水方对慢性阻塞性肺疾病合并肺动脉高压外周血内皮祖细胞计数及功能影响的临床及实验研究

冷报浪 张云霞 赵娜 王海燕 冯霞

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种以持续气流受限为特征的肺部疾病,慢性炎症可导致肺实质破坏和肺血管的异常而形成肺动脉高压。肺动脉高压是COPD 的重要并发症之一,是 COPD 病程发展为肺源性心脏病(肺心病)的关键环节,严重影响COPD 患者的生存质量及预后［1］。如能早期有效地控制肺动脉高压,对提高COPD 患者的生存质量,改善预后,防止肺心病的发生具有重要意义。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是内皮细胞的前体细胞［2］,EPCs 在COPD 合并肺动脉高压形成过程中起着重要的作用,研究显示中药治疗可以有效改善EPCs 功能,从而有效地治疗COPD 合并肺动脉高压［3］。因此,本研究应用宁肺活血利水方治疗COPD 合并肺动脉高压患者取得较好疗效,并研究对外周血EPCs 数量及功能的影响,进一步通过动物实验探讨相关机制,现报告如下。

1 临床研究

1.1 资料与方法

1.1.1 一般资料 选取2018 年11 月～2021 年11 月本院呼吸内科接治的门诊或住院的60 例COPD 合并肺动脉高压患者,所有病例符合C0PD 合并肺动脉高压的诊断标准［4,5］,且为急性发作期［6］。采用随机数字表法将患者分成对照组和研究组,各30 例。

1.1.2 治疗方法 对照组参照COPD 诊治规范［4］采用常规抗感染、止咳、化痰、平喘及对症治疗。研究组在对照组的基础上口服宁肺活血利水方,方药组成：桑白皮10 g、泽兰10 g、浙贝母10 g、葶苈子6 g、法半夏10 g、丹参20 g、瓜蒌皮15 g、广郁金10 g。水煎服,1 剂/d。两组均不得使用其他血管活性药物,疗程均为4 周。

1.1.3 观察指标及判定标准 比较两组治疗前后中医证候积分、肺动脉压、外周血EPCs 计数及功能、临床治疗效果。

1.1.3.1 EPCs 计数及功能 在无菌条件下清晨抽取患者空腹状态下的肘静脉血15 ml,使用肝素抗凝并轻轻混匀,4 h 内离心分离血清,分装后保存于-80℃冰箱,标本收集完成后统一进行实验研究。参照文献方法［7,8］对标本进行EPCs 分离、培养鉴定及计数,以淋巴分离液经密度梯度离心法获得单个核细胞,进行体外培养,免疫荧光法鉴定双荧光阳性细胞得到EPCs,最后应用流式细胞仪计数每10 万个单个核细胞中CD34+VEGFR-2+CD45-的EPCs 所占的比例。按实验步骤,在 EPCs 中加入 LCCK-8 溶液培养,酶标仪测定在450 nm 处的吸光度,测定EPCs 增殖能力；用胰蛋白酶消化液、PBS 洗脱后,计数贴壁细胞,测定EPCs 粘附能力；用胰蛋白酶消化液、EBM-2 培养后,计数迁移到底层的细胞数,测定EPCs 迁移能力。

1.1.3.2 中医证候积分、肺动脉压 参照《中医内科病证诊断疗效标准》［9］对患者的症状、体征等进行评分,主要包括咳嗽、咳痰、胸闷、喘憋、气短、乏力、心悸、哮鸣音、睡眠等,每项0～3 分,0 分为无症状；1 分为轻微；2 分为较明显能忍受,但不影响生活；3 分为显著并影响生活。采用多普勒超声心动图法测定患者肺动脉压的变化。

1.1.3.3 疗效判定标准［10］通过尼莫地平法,根据治疗前后肺动脉压变化情况进行疗效评价：控制：症状、体征基本消失,中医证候积分下降≥95%,且肺动脉压恢复到正常水平；显效：症状、体征有显著改善,70%≤中医证候积分下降<95%,肺动脉压降低>15%；有效：症状、体征有所缓解,30%≤中医证候积分下降<70%,肺动脉压降低5%～15%；无效：症状、体征无显著改善,未达到上述标准。总有效率=(控制+显效+有效)/总例数×100%。

1.1.4 统计学方法 采用SPSS18.0 统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差()表示,采用t 检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

1.2 结果

1.2.1 两组患者治疗前后中医证候积分、肺动脉压比较 治疗前,两组患者中医证候积分、肺动脉压比较,差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后,两组中医证候积分、肺动脉压均较治疗前降低,且研究组显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组患者治疗前后中医证候积分、肺动脉压比较 ()

表1 两组患者治疗前后中医证候积分、肺动脉压比较 ()

注：与本组治疗前比较,aP<0.05；与对照组治疗后比较,bP<0.05

1.2.2 两组患者治疗前后外周血EPCs 计数及功能比较 治疗前,两组患者EPCs 计数、EPCs 增殖能力、EPCs 迁移能力、EPCs 粘附能力比较,差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后,两组EPCs 计数、EPCs 增殖能力、EPCs 迁移能力、EPCs 粘附能力均较治疗前升高,且研究组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组患者治疗前后外周血EPCs 计数及功能比较()

表2 两组患者治疗前后外周血EPCs 计数及功能比较()

注：与本组治疗前比较,aP<0.05；与对照组治疗后比较,bP<0.05

1.2.3 两组患者临床治疗效果比较 研究组的治疗总有效率为93.33%,明显高于对照组的73.33%,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 两组患者临床治疗效果比较 (n,%)

2 动物实验

2.1 材料与方法

2.1.1 材料 收集30 只8周龄的雄性SD 大鼠,体质量150～200 g。适应性饲养2周。随机分为模型组、干预组及空白对照组,每组10 只。

2.1.2 方法 先进行动物造模,模型组及干预组于项背部皮下注射 1%的野百合碱(monocrotaline,美国Sigma 公司)50 mg/kg,以诱导形成肺动脉高压模型;空白对照组注射等量PBS。注射当天为第0 天。干预组于第3 天开始予以宁肺活血利水方水煎液20 ml/kg灌胃,宁肺活血利水方方药组成同临床研究,由医院中药房自动煎药机煎煮成水煎液,每剂中药剂量煎成150 ml×2 袋；模型组以等量蒸馏水灌胃,总共21 d。第21 天三组大鼠经尾静脉取血,进行循环EPCs 含量测定,并分别采用EPCs 体外培养8 d 进行相对增殖能力检测、用PBS 洗脱法进行相对粘附能力检测、用单层细胞法进行相对迁移能力检测［11］。经静脉采血后的大鼠以10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉,自右侧颈外静脉插管至右心室,应用PM-8000 型多参数监护仪测定RVSP,以此间接反映肺动脉压［12］。

2.1.3 统计学方法 采用SPSS18.0 统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差()表示,采用t 检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2.2 实验结果 空白对照组RVSP 低于模型组及干预组,EPCs 计数、EPCs 增殖数、EPCs 粘附能力、EPCs 迁移能力高于模型组及干预组,差异有统计学意义(P<0.05) ；干预组RVSP 低于模型组,EPCs 计数、EPCs 增殖数、EPCs 粘附能力、EPCs 迁移能力高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 三组大鼠RVSP、静脉血中EPCs 计数及功能比较()

表4 三组大鼠RVSP、静脉血中EPCs 计数及功能比较()

注：与空白对照组比较,aP<0.05；与模型组比较,bP<0.05

3 讨论

COPD 由于反复发作常致伴发肺动脉高压,而肺动脉高压是COPD 向肺心病发展的中心环节。治疗上降低肺动脉压和肺血管阻力有积极意义,但血管扩张剂由于选择性差使临床应用受限,虽然有新的药物与疗法的开发和应用使得肺动脉高压的临床症状能够在一定程度上得到改善,但远期预后依旧不佳,且在COPD合并肺动脉高压患者,中作用未得到证实［13］。国内中西医结合的研究显示,中医药有较好的降肺动脉压作用。祖国医学认为COPD 可按咳嗽、喘证、哮证、痰饮、肺胀、胸痹等范畴辨证论治,其病因病机复杂,特别是COPD 发展到肺动脉高压阶段由于病情反复发作,病机错综和病理因素复杂及相互影响和转化,其痰浊久留,肺气郁滞,心脉失畅,瘀阻血脉,“血不利则为水”,终至痰、血、水错杂为患。“法随证立、方从法出”,故确立了复法合方辨治手段,应用宁肺活血利水方治疗COPD 合并肺动脉高压患者,该方由桑白皮、葶苈子、浙贝母、法半夏、泽兰、丹参、瓜蒌皮及广郁金等组成。全方具有宁肺活血利水之功,又具化痰泻肺平喘之效,可达气血水诸证兼顾之能。本文前期研究结果显示［14］,该方对治疗COPD 合并肺动脉高压患者有较好的临床疗效,本课题进一步研究了该方治疗COPD 合并肺动脉高压患者的疗效,并研究对外周血EPCs 数量及功能的影响,同时,通过动物实验探讨相关机制。

本研究结果显示,研究组患者在常规对症治疗基础上加用宁肺活血利水方,治疗4 周。治疗后研究组患者中医证候积分显著低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),与相关研究报道基本一致［15］。由此看出,宁肺活血利水方有助于改善COPD 合并肺动脉高压患者的症状。同时,治疗后,两组肺动脉压均较治疗前降低,且研究组显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。提示在常规西药治疗基础上服用中药宁肺活血利水方,能有效降低肺动脉压,进而改善心肺功能,显示了中西医结合在COPD 合并肺动脉高压治疗中的临床价值。

在COPD 的反复发作过程中,由于肺血管内皮细胞的损伤并呈进行性加重,导致肺动脉高压以及肺心病,研究显示血管祖细胞参与内膜增生的发病机制主要通过血管内皮生长因子(VEGF)相关信号［16］。内皮细胞受到各种病理因素刺激损伤后会逐渐导致血管内皮功能障碍。EPCs 是内皮细胞的前体细胞,研究发现COPD 患者的长期缺氧状态以及炎症因子刺激可导致外周血EPCs 数量减少和功能受损,在COPD 肺动脉高压形成过程中起着重要的作用［17］。因此,改善COPD 患者外周血的EPCs 计数及功能,可以保护并修复COPD 患者的血管内皮功能,改善肺动脉高压,对于COPD 合并肺动高压的防治具有重要意义。既往的研究显示［18］,在体外试验中具有活血化瘀作用的姜黄素可增加COPD 患者外周血EPCs 计数,并改善EPCs 增殖功能。

在本课题临床研究中发现,治疗后,两组EPCs 计数、EPCs 增殖能力、EPCs 迁移能力、EPCs 粘附能力均较治疗前升高,且研究组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。显示宁肺活血利水方在有效降低肺动脉压的同时,能增加 COPD 合并肺动脉高压患者外周血EPCs 计数,并明显改善EPCs 增殖能力、迁移能力、粘附能力。在动物实验中,经野百合碱造模的肺动脉高压大鼠予以宁肺活血利水方水煎液灌胃治疗后,干预组RVSP 低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。客观地证实了宁肺活血利水方能有效降低肺动脉压。同时发现,大鼠尾静脉血循环EPCs 含量增加,对分离的EPCs 分别进行增殖能力、迁移能力、粘附能力检测,结果显示,干预组EPCs 计数、EPCs 增殖数、EPCs 粘附能力、EPCs 迁移能力高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。

综上所述,在常规对症治疗基础上加用宁肺活血利水方能有效提高COPD 合并肺动脉高压患者的临床疗效,能明显降低肺动脉压,进而改善心肺功能；能够有效增加外周血EPCs 计数,明显改善EPCs 增殖能力、迁移能力、粘附能力,这可能是宁肺活血利水方有效降低肺动脉压的一个重要机制。