复配组合物中6 种成分含量检测方法研究

陈慧芳，何敬愉，刘林峰，潘丹阳，陈英杰，龚盛昭，

（1.广州环亚化妆品科技股份有限公司，广东 广州 510700；2.广东轻工职业技术学院，广东 广州 510300）

黄芩、大黄、金银花、蒲公英、龙胆草、黄柏是历史悠久、医用价值高的传统中药，具有清热解毒、消肿祛腐的功能，也是常见具有抗菌作用的提取物［1-6］，由这些提取物按一定比例复配成广州环亚化妆品科技有限公司研发的祛痘组合物，作为核心功效成分应用于化妆品中，深受消费者喜爱。痤疮丙酸杆菌（PA）与痤疮密切相关，是诱发和加重痤疮的重要因素之一。抑制PA 的生长是目前治疗痤疮和预防痤疮的重要手段。黄岑（Scutellaria Baicalensisi Georgi）是唇形科植物黄岑的干燥根，黄酮类化合物黄芩苷（Baicalin， C21H18O11）是其主要成分之一，黄芩苷具有广谱的抗菌活性，离体实验表明，黄芩苷在相同浓度下抑制痤疮丙酸杆菌的作用是甲硝唑的 2 倍，是红霉素的 115 倍［5］。大黄（Rheum Palmatum L.）为蓼科大黄属植物大黄的干燥根，研究显示大黄主要活性成分大黄素对引起痤疮的痤疮丙酸杆菌（PA）具有明显的抑制作用［2］。金银花、蒲公英、黄柏，龙胆草等均对痤疮丙酸杆菌有抑制作用［6］。因此将能反映药材品质的化合物如金银花中的绿原酸、蒲公英中的咖啡酸、龙胆草中龙胆苦苷、黄柏中的小檗碱、黄芩中的黄芩苷和大黄中的大黄素纳入含量测定中。

复配组合物中药味多，成分复杂，药材质量参差不齐，在品控时单一的化学成分测定很难反映整个组合物的质量优劣，以及难以监测其品质，分别测定时，存在检测成本高、时间长等缺点。王冬等人［7］通过超高效液相色谱法（UPLC）同时测定了药物制剂中大黄素、咖啡酸、绿原酸、野黄岑苷、木樨草素和虎杖苷6 种成分的方法，该方法操作快速、高效、准确。高旭东等人［8］建立栀子金花丸中栀子苷、黄芩苷、小檗碱和大黄色韩浪分析的双波长HPLC 法，方法精密度高、重现性好、结果准确。因此，本研究以绿原酸、咖啡酸、龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷、大黄素为外标，建立同时分析多种药材和复配组合物的特征成分的HPLC-DAD 分析方法，以期为药材和复配组合物制定质量控制标准。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

超纯水机（北京莱特有限公司）；QC150 超声波清洗器（上海先光器械厂）；高效液相色谱仪：1260 型串联DAD 检测器（美国安捷伦公司）；SY - 2000 型旋转蒸发器（上海荣亚生化仪器厂）；水浴锅：DSY-2-8 型（北京国华医疗器械厂）；JJ300B 精密电子天平（瑞士 Starorius 公司）。

1.2 材料

金银花、蒲公英、龙胆草、黄柏、黄芩、大黄均购于广州大参林药店；磷酸、甲醇、无水乙醇均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯）、绿原酸、咖啡酸、龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷、大黄素购于阿拉丁（上海）股份有限公司。

2 实验方法

2.1 供试品溶液的制备

采用回流提取的方法提取金银花、蒲公英、龙胆草、黄柏、黄芩和大黄等单味药材或按一定生药比例复配而成的的祛痘组合物，提取溶剂为纯化水、料液比1∶10（g/mL）、提取温度80℃，回流提取60 min，过滤收集滤液，滤液采用D101 大孔吸附树脂吸附洗脱，先用水洗脱，水洗脱液弃去，再用70%乙醇洗脱，收集醇洗脱液。醇洗脱液用低温旋转蒸发浓缩，甲醇定容至2 mL，0.45 μL 有机滤膜过膜，装入样瓶中备用。

2.2 对照品贮备液的配制

分别精密称取1 mg 绿原酸、咖啡酸、龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷、大黄素标准品，分别用色谱级甲醇溶解定容至10 mL。6 种标准品溶液各吸取1 mL 混合用色谱级甲醇定容至10 mL，得到混合标准品溶液，备用。

2.3 HPLC 分析条件与方法适应性试验

（1）检测波长的确定：根据文献［9-13］，用紫外分光光度计对绿原酸、咖啡酸、龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷、大黄素6 种标准品溶液进行200~400 nm 波长扫描，选择适合的分析波长。

（2）色谱条件：Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-C18（4.6×150 mm 2.7 μm），流动相为甲醇-0.05% 磷酸水溶液，梯度洗脱：0~6 min，10%~25% ；6~15 min， 25%~30% ；15~21 min，30%~40% ；21~27 min， 40%~55% ；27~40 min，55%~90%；流速 1 mL/min、柱温40℃。

2.4 方法学考察

（1）标准曲线的制作：将2.2 配制好的混合标准品溶液过0.45μm 滤膜，用上述色谱条件分别进样 5，10，15，20，25，50 μL，绘制标准曲线。

（2）精密度分析：分别配制绿原酸、咖啡酸、龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷、大黄素6 种特征成分标准品，分别在上述色谱条件下日内6 个不同时间点进行进样分析，由测得面积（A）计算标准偏差（SD）和相对标准偏差（RSD），获得日内精密度值。

（3）重复性分析：按2.1 的方法，用同一批中药材复配的祛痘组合物制备6 份祛痘组合物提取液在上述色谱条件下进样，由测得6 种特征成分面积（A）计算相对标准偏差（RSD），分析重复性。

（4）稳定性分析：配制6 种标准品特征成分的混合标准溶液，室温静置，分别于0，2，4，6，8，12，24 h 进样，由测得各特征成分面积（A）分析溶液稳定性。

（5）样品回收率分析：称取 6 份已测定了各特征成分的复配组合物，按2.1 方法制备供试溶液，加入适量混合标准液，在最优色谱条件下进样，分析样品并计算回收率。

2.5 样品中各特征成分液相色谱法含量分析

按照2.1 制备6 种药材和复配组合物待测液，各平行3 份，进样10μL，计算样品中复配组合物含量。

3 结果与分析

3.1 色谱结果

3.1.1 检测波长的确定

通过HPLC 全波长扫描可知（见图1），要同时测定6 种特征成分标准品以及样品，考虑到各组分的灵敏度并避免其他组分干扰，选择280 nm 波长作为检测波长较为合适。

图1 6 种成分的在线紫外光谱图

3.1.2 色谱图分析

图2a~2f 中分别为6 种单一标准品及单一药材提取物的色谱图，g 图为混合标准品复配组合物色谱图，峰1 至峰6 分别为绿原酸、咖啡酸、龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷、大黄素。从图中可以看出，上述色谱条件下样品以及复配组合物中的各特征成分均可实现有效分离。

3.2 方法学考察

3.2.1 标准曲线的制作与检出限

以进样量为横坐标x 轴，峰面积为y 轴，绘制6 种特征成分的标准曲线，见表1。由表1 可知，在5.43~144.0 μg/L 范围内，6 种标准品都表现出良好的线性关系。

表1 6 种成分标准品线性关系表

3.2.2 精密度分析

由表2 可知，在280 nm 波长下，6 种特征成分的RSD 都小于2.76%，表明本方法精密度良好。

表2 精密度分析结果

3.2.3 重复性分析

表3 为同一配比的复配组合物6 个平行样品的重复性分析。由表3 可知，在280 nm 波长下，祛痘组合物样品中6 种特征成分的RSD 均在2.56%内，表明本方法重复性良好。

3.2.4 稳定性分析

由表4 可知，室温静置下，280 nm 波长下6种特征成分的RSD 均小于2.07%，表明本方法稳定性良好。

3.2.5 回收率分析

由表5 可知，6 种特征成分在本方法下加标回收率为95.72%~103.20%，RSD 小于4.76%，说明本方法结果可靠。

3.3 样品中特征成分含量的检测

图2 6 个成分标准品、6 种药材及组合物的HPLC 色谱图

表3 重复性分析结果

表4 稳定性分析结果

根据2.1 中的方法得到的单味药材和复配组合物，按2.4 的方法测定，不同样品中特征成分含量的结果见表6。

4 结论

本研究利用高效液相色谱法建立了同时检测绿原酸、咖啡酸、龙胆苦苷、小檗碱、黄芩苷和大黄素等6 种成分的HPLC 分析方法。6 种成分在该方法下分离效果良好，精密度高、重现性好、准确度高。该方法使用的C18为常见色谱柱，购买方便，流动相为甲醇和磷酸水，容易配制，具有简单、快速、高效、适用性广等特点，可用于药材原料和复配组合物的质量控制，也可为含有相关药材的其它组合物的质量控制提供参考。

表5 回收率分析结果 （n=6）

表6 不同样品中6 种成分含量差异 （n=3）