流行性脑脊髓膜炎的实验室分子诊断研究进展

石刚 徐颖华 叶强

流行性脑脊髓膜炎（简称流脑）是由脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis，Nm）引起的一种急性呼吸道传染病［1-2］。根据细菌表面荚膜多糖的不同，将Nm可分为12 个血清群，但绝大多数流脑病例是由A、B、C、W、X 和Y 血清群菌株所引起［3-4］。Nm经呼吸道感染后临床症状轻重悬殊，轻可表现为持续无症状带菌状态，而暴发型病情凶险，进展极其迅速，可在24 h 内死亡［5］。研究发现10%～20%的存活者可能会有脑部损伤、失聪等后遗症［6-7］。随着近几十年的脑膜炎球菌疫苗的广泛使用，大幅度降低流脑发病率。但据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）统计报道，在2019年全世界仍有250 万流脑病例，其中包括近20 万死亡病例，严重影响人们生命健康［8］。可靠、灵敏的实验室诊断方法可为流脑临床诊断和流行病学监测研究提供可靠的手段和依据。随着生物技术的发展，基于不同技术原理的快速分子检测方法被开发和应用，显著提高了不同层级实验室Nm检出率和灵敏度，并减少了诊断侵袭性脑膜炎球菌疾病所需的时间［7-8］。本文就目前国内外流脑实验室快速分子诊断的研究进展作一综述，以期为后续流脑的预防和控制奠定一定基础。

1 传统的细菌培养法

传统的细菌培养法作为细菌性脑膜炎实验室诊断的金标准，是通过对疑似患者脑脊液（CerebroSpinal Fluid，CSF）进行细菌培养检测，但检测结果易受CSF 采集及运输保存方式、疑似患者免疫状态、以及是否服用过抗生素等因素影响，且检测时间长、检出率低、不利于疑似患者的快速诊断和治疗，远远不能满足目前的临床诊断需要［9］。

2 快速检测和分子检测方法

2.1 快速检测方法

研究人员应用抗A、W135、Y 和C 群Nm多糖的单克隆抗体，构建双重免疫学快速检测方法。通过与细菌培养法及PCR 方法的平行验证研究，证实所建立的快速检测方法对参考菌株的敏感性和特异性为100%，而对CSF 样品所含A、W135、Y 和C群Nm的敏感性和特异性为93.8%～100%［10-11］。

在非洲一项历经5年的快速检测试纸条的现场评估研究发现，现场工作人员和参考实验室专业人员检测2 095 份CSF 样品的分析结果一致性高达94%，且检测结果与细菌培养和实时PCR检测结果的一致性为89%，方法的灵敏度和特异性分别为91.5%和84.6%。表明该方法可经过培训但非专业的工作人员操作并可获得良好的检测结果，尤其适合卫生设施相对简单的基层使用［12］。

2.2 环介导等温扩增

环介导等温扩增（Loop mediated isothermal amplification，LAMP）是在21世纪初发展起来的新技术。该方法仅需简单的水浴，但仍具有高效扩增和特异性高的优点，被广泛用于不同病原体的分子诊断［13-15］。研究人员应用LAMP 检测技术对Nm分子诊断方法研究，发现含高拷贝靶基因的样本可在16 min 出现阳性颜色变化，方法的最低检出限为6 个拷贝，通过与391 例临床样品常规实时PCR 检测结果比较，LAMP 方法灵敏度和特异性分别为100%和98.9%，极大节省了检测成本和时间［16］。该方法被英国贝尔法斯特皇家儿童医院作为急诊实验室诊断手段之一［17］。同时，通过对DNA 进行引物与探针的改变，不断完善和改进LAMP 检测方法，包括开发出可检测几种脑膜炎相关病原体的多重LAMP 检测方法，成本低、灵敏度为90.9%、特异性为100%［18］。由于LAMP 检测对设备的要求不高，因此对于资源有限的实验室或者基层医院是一种很有吸引力、能用于脑膜炎等传染病的分子实验室诊断方法。

2.3 线性探针技术

线性探针技术（line-probeassay，LipA）是通过DNA 扩增-杂交反应来检测Nm基因位点突变状态，用于CSF 标本中Nm及耐药性的检测分析。Ahmet Soysal 等［19］应用该技术对751 例CSF 样本进行了脑膜炎病原体诊断，并与PCR 方法进行比较。发现127 例为肺炎链球菌阳性，53 例为b 型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae type b，Hib）阳性，41 例为Nm阳性，以PCR 结果为参照，LipA对肺炎链球菌、Hib和Nm的特异性为88%，建议LipA 检测可用于细菌性脑膜炎病原体CSF 标本临床分子诊断和流行病学监测研究。

2.4 PCR 检测技术

与传统细菌培养方法相比，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测方法不会因服用抗生素或样品运送与处理而导致待检测样品中活菌死亡而影响［20-21］。研究发现常规PCR 对流脑诊断阳性率达91%～100%，假阴性少见，小于5%［22］。Whiley 等［23］报道的流脑双重PCR 检测方法，即在同一PCR 反应体系中加入针对Nm两个靶基因porA与ctrA的两对引物进行扩增，提高试验的灵敏度和特异性。

目前采用PCR 不仅可以检测细菌靶基因，也可分析感染菌株的血清群。研究人员应用多重PCR 方法对2015-2018年在土耳其收集994 例疑似脑膜炎患者的CSF 样本进行分析，发现89 例为Nm感染，随后对不同血清群特异性包括针对X 群Nm 的ctrA基因、B、C、W 和Y 群Nm的特异性siaD基因和A 群Nm的orf-2基因引物进行PCR扩增，结果证实绝大多数流脑感染为B 群流脑，共45 例，而W 群流脑病例为9 例［24］。

尽管PCR 检测方法是一种快速、准确、灵敏度高与特异性强的检测流脑感染方法，但其实际应用和所用检测靶基因还未在全世界范围内形成统一的规定［25］。例如，在欧盟，仅有25%的病例仅是通过PCR 确诊，而在英国和爱尔兰，这一比例约为50%；在美国，CDC 直到2010年以后才在其病例定义中将PCR 作为实验室诊断确诊检测方法［26］。

2.5 检测多种呼吸道病原体的多重实时PCR

为了满足临床诊断需要，近几年，多重实时PCR（Multiplex Real-time PCR polymerase Chain Reaction，MRT-PCR）技术应用越来越广泛。研究人员建立可同时检测肺炎链球菌（靶基因plyA）、Hib（靶基因bexA）和Nm（靶基因ctrA和sodC）的多重实时PCR 方法［27］。在一份收集122 份疑似流脑患者CSF 样本比较分析中，发现50 例阳性样本，包括32 例肺炎链球菌、12 例Nm和1 例b 型流感嗜血杆菌，MRT-PCR 提高了疑似流脑患者的阳性检出率，进一步增加了反应的灵敏度和特异性［28］。

任红宇等［29］研究人员通过优化单一PCR 扩增体系及扩增程序，建立了检测Nm、Hib、肺炎链球菌等8 种病原体的多重实时PCR 方法，此方法具有较高的灵敏度，且检测快速，适合临床疑似细菌性脑膜炎感染病例的检测与筛查，提高阳性诊断率。

尽管CSF 的常规化学和细胞分析可能有助于迅速区分细菌和病毒感染，但无法确定具体的病因［30-31］。为了助力精准诊断，研究人员建立检测CSF 中14 种病原微生物（细菌、病毒、真菌）的多重实时PCR 方法，研究结果表明该方法的细菌性病原体阳性检出符合率为97.5%，病毒为90.1%，真菌为52%，实验反应时间不超过60 分钟，与常规PCR 方法比较，阴性符合率大于99.9%［32］，且能够检测到单独的、有针对性检测而不被发现的混合感染病例。因此，MRT-PCR 也必将推动临床实验室快速、精准检测能力的发展。

2.6 全基因测序方法

宏基因组二代测序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）由于可以不依赖于培养结果，直接从样本中获得病原体的核酸序列信息，被越来越多地应用于包括对细菌性脑膜炎在内的各种病原体引起中枢神经系统感染的诊断。

研究人员通过对mNGS 诊断感染性脑膜炎和脑炎的情况进行了为期一年的研究，共检测出32例感染，而常规直接检测（即指CSF 培养、PCR 或抗原检测，不包括血清学检测或CSF 以外的样本检测）仅检测出27 例；其中19 例用常规检测和宏基因组方法均检测出病原体；结果表明，CSF 样本的宏基因组测序在诊断传染性脑膜炎和脑炎的有效性，有助于改善脑膜炎和脑炎的病原体诊断，并在部分病例中对医生的治疗方案有指导作用［33］。通过对95 例患者样本进行盲法mNGS 测试来评估诊断的准确性，与原始临床诊断结果相比，mNGS 方法的灵敏度和特异性分别为73%和99%。随后对从一组患有脑膜炎、脑炎和或脊髓炎的儿科患者中收集的20 份阳性CSF 样本进行mNGS 挑战试验，相对于CSF 的常规细菌培养检测，发现mNGS 方法在检测致病性病原体方面的敏感性和特异性分别为92%和96%。这些结果进一步证实了mNGS 方法直接检测病原体分析性能。mNGS 的优势在于，不依赖针对目标病原体的经验知识，能够在一次化验诊断中检测出更多的感染因子。通过一次分析来识别潜在病因综合谱一病毒、细菌、真菌和寄生虫，是一种很有前景的传染病诊断方法［34］。

3 小结与展望

在长期研究建立与发展的流脑实验室诊断方法中，经典的细菌培养法虽然特异性好，但耗时长，灵敏度低，不利于疑似患者的快速诊断和治疗。近些年开发的流脑快速检测试纸条方法、简便、快捷，适合于基层医院开展，具有较大的实用性。毋庸讳言，以PCR 为基础的分子检测方法是流脑诊断技术中灵敏度和特异性最高的检测方法，是流脑诊断技术一次里程碑的进展，只要严格规范操作，避免假阳性、阴性结果出现，LAMP 检测是一种恒温核酸扩增的新型技术，具有特异性高、时间短、操作简单等优点，适用于不用层级实验室。事实上，在一些国家，已经批准涵盖多种呼吸道病原体检测的商业化PCR 试剂盒用于临床实验室诊断用［22］。但不可否认，虽然PCR 检测成本持续在下降，在一些资源匮乏和缺乏训练有素工作人员的国家和地区要引进PCR 检测方法还是具有一定难度。为了更好的加强流脑的预防和控制，全球脑膜炎球菌倡议组织推荐，有条件的省级或地市级实验室都应开展PCR 检测Nm方法，可快速获得（在数小时内）检测结果。此外，建议也应对使用的PCR 检测方法进行验证，并不取代细菌培养方法，并通过后者获取细菌资源，共同促进流脑感染的防控［35］。

mNGS 分析的特异性仅次于金标准细菌培养方法，通过对脑膜炎和其他临床症患者的早期临床研究，证实了直接通过对标本进行mNGS 分析能够获得具有挑战性的感染诊断。然而，在已发表的回顾性病例研究中，由于应用mNGS 检测而有益于临床治疗的患者比例较低，且检测成本较高，这提升了我们对患者“何时进行检测”以及mNGS检测适合哪些患者理解的重要性［36］。此外，在临床试验室实施mNGS 还面临参考标准、生物信息学分析以及不同国家公共卫生政策和监管等问题。

当前我国流脑实验室诊断相关研究很少，而流行病学监测研究均需要可靠的实验室检测方法。因此，加强流脑感染的实验室分子诊断的研究是我国目前的当务之急。只有可靠的流脑实验室诊断和检测方法才能提供更加全面的流脑流行病学和实验室监测数据。因此，为了系统评价我国流脑的疾病负担，建议进一步加强流脑监测能力，尤其是一些地区尚不具备流脑实验室监测能力，推荐将检测病原体敏感的RT-PCR 方法用于哨点检测，提高病原体阳性检出率。