猪圆环病毒3型检测方法及感染现状概述

祖立闯，李 娇，谢金文，李 峰，王文秀，4

（1.淄博市动物疫病预防与控制中心，山东 淄博 255000；2.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；3.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；4.山东省院士工作站，山东 滨州 256600）

2015年6月，美国某猪场发生了一起母猪皮炎肾病综合征和繁殖障碍为主要特征的疫病，Palinski等[1]研究表明该病例的致病原为一种新型猪圆环病毒，命名为猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3, PCV3），随后我国研究学者在国内养猪密集地区陆续检测并分离到PCV3，且进一步研究表明PCV3具有类似PCV2（Porcine circovirus type 2, PCV2）的临床症状和致病性，推断PCV3将类似PCV2成为危害我国养猪业的又一个免疫抑制性疫病[2-5]。故当前加强PCV3的诊断和流行病学监测，对PCV3的综合防控和保障我国养殖产业健康发展均具有十分重要的现实意义。鉴于此，笔者就目前我国PCV3各种实验室诊断技术的最新研究进展和PCV3的感染现状进行概述，为提高我国PCV3实验室诊断水平以及改善PCV3综合防控措施提供参考。

1 PCV3的检测方法

1.1 PCR方法

PCR方法是当前体外扩增DNA最简单、快速的分子生物学检测技术，在基层兽医实验室得到了广泛应用。杨威等[6]和姜玲玲等[7]分别根据PCV3特异性序列设计引物，经PCR反应条件的优化，均建立了PCV3 PCR检测方法，能够分别特异性扩增出418 bp和649 bp目的基因片段，能够扩增的最低模板量分别为1.13×10-3ng/μL和0.143 ng/μL。杨威等[6]和姜玲玲等[7]建立的PCR检测方法操作简单、检测快速，可用于PCV3的快速检测和流行病学调查。

1.2 套式PCR方法

套式PCR方法由常规PCR方法引申而来，其经过二轮PCR扩增反应，第2轮PCR扩增反应以第1轮PCR扩增产物为模板，大幅增加了检测的敏感性。张静等[8]根据PCV3全基因组保守区域设计2对特异性引物，建立PCV3套式PCR检测方法，该方法仅对PCV3检测呈阳性，最低检测限为1.74×10拷贝/μL，与商品化检测试剂盒的符合率较高，可用于PCV3核酸的低含量检测。杨永宁等[9]根据PCV3基因序列设计合成了内、外两对引物，建立PCV3套式PCR检测方法，该方法检测PCV2、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）均为阴性，外引物PCR扩增的检测灵敏度为17 ng DNA，内引物PCR扩增的检测灵敏度为0.17 ng DNA，可用于临床病料中PCV3的快速检测。套式PCR方法所用试验试剂和操作方法均与常规PCR方法相同，但其由于增加了一轮PCR扩增反应，导致其检测所需时间有所延长。

1.3 荧光PCR方法

荧光PCR方法是将光谱技术引入到PCR扩增反应，其融汇了常规PCR方法快速、特异性扩增的优点和光谱技术精确定量的优点，克服了常规PCR方法不能定量、需要核酸电泳检测等缺点，但荧光PCR方法试验操作技术要求较高、试剂成本较高。杨斌等[10]根据PCV3 Cap基因保守区域设计了特异性引物和探针，建立了PCV3 TaqMan荧光定量PCR检测方法，该方法的检测灵敏度可达到11.8拷贝/μL，组内和组间重复试验的变异系数均小于2%，检测PCV2、CSFV、PRRSV、PRV均为阴性。骆辉等[11]根据GenBank中PCV3全基因组序列高度保守区域设计了1对特异性引物和探针，通过对反应体系和扩增条件进行优化，建立了能够特异性检测PCV3的荧光定量PCR方法，该方法的最低检出浓度为7.87×10-1拷贝/μL，检测PCV2、PRV、PPV、PRRSV、猪乙型脑炎病毒（JEV）、TGEV、PEDV均为阴性，组内和组间重复性试验的变异系数均小于1%。畅通等[12]根据PCV3 ORF2基因的保守序列设计1对特异性引物和TaqMan探针，通过构建标准品质粒来制作荧光定量PCR标准曲线，优化反应条件，建立了检测PCV3的实时荧光定量PCR方法，该方法可以特异性检测出PCV3，而检测PCV2、CSFV、PRRSV、PEDV、PPV、PRV均为阴性，该方法的检测灵敏度可以达到10拷贝/μL，批内和批间重复试验的变异系数均小于2%。荧光PCR方法具有快速、灵敏性高、特异性强、定量准确等优点，可为我国PCV3的早期检测及流行病学调查提供可靠的技术支持。

1.4 等温扩增方法

等温扩增法为一种新型的核酸扩增方法，该方法无需PCR仪等特殊仪器，只需要在常规水浴锅中即可完成整个扩增反应，具有操作简单、灵敏度高、肉眼判读等优点，特别适合在现场和基层部门应用，目前在PCV3的检测中常用的等温扩增法主要有环介导等温扩增（LAMP）方法和重组酶介导等温扩增（RAA）方法。

1.4.1 LAMP方法 朱小甫等[13]根据PCV3全基因序列设计了4条特异性引物，通过反应成分和反应条件的优化，建立了检测PCV3的LAMP方法，该方法的检测极限为10个拷贝/μL质粒模板，检测PCV2、PRV、PPV、猪大肠杆菌、猪沙门氏菌DNA均为阴性，与常规PCR方法的符合率为97.6%。姜辰龙等[14]根据PCV3 ORF2基因保守序列设计特异性引物，建立了检测PCV3的LAMP方法，该方法59 ℃恒温扩增36 min即可出现梯形条带，最低检测限为1.0×10-1拷贝/μL，检测圆环病毒1型（PCV1）、PCV2、PRRSV、PRV、CSFV均为阴性，该方法与PCR方法的符合率为95.6%。相对传统PCR方法而言，LAMP方法敏感特异、简便快速，可用于PCV3快速检测和临床诊断。

1.4.2 RAA方法 吴江等[15]根据PCV3 Cap基因的保守序列设计多对引物和探针，通过筛选引物和优化试验条件，建立了一种检测PCV3的RAA方法，该方法可在39 ℃恒温条件下20 min内快速完成特异扩增反应，检测PCV2、CSFV、PRRSV、猪A型塞内卡病毒（SVA）、口蹄疫病毒（FMDV）均为阴性，最低检出浓度为10-2拷贝/μL，与常规PCR方法的符合率为100%。RAA方法操作简单、快速灵敏、结果可靠，可用于PCV3的实验室检测和现场诊断。

1.5 ELISA（酶联免疫吸附试验）方法

ELISA方法具有简单、快捷、敏感、特异、高通量等优点，特别适合大批量样品的检测和大面积的流行病学调查，是当前基层兽医实验室使用最广泛的免疫学检测技术。目前在PCV3的检测中常用的ELISA方法主要检测PCV3抗体的间接ELISA方法和检测PCV3抗原的双抗夹心ELISA方法。

1.5.1 间接ELISA方法 葛玉凤等[16]选择PCV3 ORF2基因中免疫原性较强的一段序列进行截短表达，以获得的重组Cap蛋白为包被抗原，通过间接ELISA反应条件的优化，建立PCV3重组Cap蛋白间接ELISA抗体检测方法，该方法检测PCV2、CSFV、PRRSV、PRV、PPV、PEDV、TGEV阳性血清均为阴性，对PCV3抗体的最低检出效价可达1∶25 600，批内和批间变异系数分别小于5%和10%。何博等[17]采用PCR方法对PCV3 ORF2基因主要抗原区域进行扩增，并利用原核表达系统进行截短表达，以纯化后的重组蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA抗体检测方法，对PCV3阳性血清的最低检出效价可达1∶20 480，检测PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、PRV、JEV、PEDV、TGEV等猪常见疫病阳性血清均为阴性，批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%。谢晓妍等[18]以PCV3衣壳蛋白为包被抗原，通过筛选和优化反应条件，建立一种检测PCV3抗体的间接ELISA方法，该方法批内和批间变异系数都小于5%。间接ELISA方法操作简单、检测快速、通量高，为临床中PCV3感染的诊断和流行病学调查等提供一种敏感、特异、简便、快速、高通量的血清学检测技术。

1.5.2 夹心ELISA方法 于俊楠等[19]利用抗PCV3 Cap蛋白的单克隆抗体，通过筛选最佳包被浓度、最佳包被时间、一抗和二抗最佳浓度，建立了检测PCV3的夹心ELISA方法，该方法单克隆抗体的最佳包被浓度为10 μg/mL（1∶200），一抗最佳稀释倍数为1∶4 000稀释，二抗最佳稀释倍数为1∶5 000，能够特异性检测PCV3，与PCV2等多种病毒不存在交叉反应，批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%。夹心ELISA方法可用于临床中PCV3的鉴别检测，特别适合于PCV3的大面积流行病学调查。

1.6 胶体金免疫层析方法

胶体金免疫层析方法是将胶体金标记技术、层析分离技术引入到免疫学反应，具有不需特殊仪器、简便、快速、结果判断直观等优点，在动物疫病快速检测中显示出了良好的应用前景。高茵[20]利用原核表达系统获得大小为42 kDa的PCV3-Cap蛋白，经过Western Blot验证PCV3-Cap蛋白能与鼠源抗PCV3单克隆抗体进行特异性的结合。将重组PCV3-Cap蛋白固定于检测线，将鸡抗葡萄球菌A蛋白（SPA）抗体固定于质控线，通过对胶体金的最佳标记pH、最佳SPA标记量、胶体金复溶液最佳划膜浓度进行筛选，组装检测PCV3的胶体金试纸条，该试纸条的胶体金最佳标记pH为8.0，最佳SPA标记浓度为2.5 μg/mL，最佳质控线划线浓度为0.4 mg/mL，该试纸条具有良好的稳定性和特异性，密封干燥保存2个月仍具有良好的灵敏性，临床随机检测结果显示胶体金免疫层析试纸条与ELISA检测结果完全一致。胶体金免疫层析方法具有简便、快速、稳定等优点，特别适合于广大基层兽医人员使用，具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景。

2 PCV3的感染现状

随着我国养猪产业的快速发展，猪群异地流动加剧，动物疫病的发生与流行率随之增加，研究学者高度重视动物疫病的流行病学监测，掌握不同地区PCV3的感染情况，可及时准确的因地制定综合防控措施。何庆等[21]采用PCR方法对2015—2017年湖南省680份猪流产胎儿病料样品进行PCV3检测，PCV3阳性率为24.4%。赵晶等[22]采用PCR方法对2018—2020年广西1 308份猪组织病料样品进行PCV3检测，PCV3阳性率为5.58%。刘燕等[23]采用PCR方法对2017—2019年郑州地区1 175份猪组织病料样品进行PCV3检测，PCV3阳性率为14.6%。何世成等[24]采用荧光PCR方法对湖南省14个市州821份临床病料样品进行PCV3检测，PCV3阳性率为33.98%。高诗敏等[25]采用PCR方法对2019年山西省11地市521份猪肺脏组织样品进行PCV3检测，PCV3阳性率为85.22%。肖兴等[26]采用PCR方法对湖南省和京津冀地区523头断奶仔猪血清样品进行PCV3检测，PCV3阳性率为68.75%。雷明霞等[27]采用PCR方法对内江市14个病死畜禽无害化场108份病料样品进行PCV3检测，PCV3阳性率为12.9%。师乾凯等[28]采用PCR方法对2017—2018年河北省60个猪场310份临床病料样本进行PCV3检测，PCV3阳性率为16.5%。魏其等[29]采用巢式PCR方法对北疆地区40份猪血液样品进行PCV3检测，PCV3阳性率为50.0%。李蕊等[30]采用PCR方法对北京市8个区县56个养殖场1 177份临床样品进行PCV3检测，PCV3阳性率为1.0%。曾彩虹等[31]采用PCR方法对云南省12个地市29县区431份临床样品进行PCV3检测，PCV3阳性率为9.98%。郭影成等[32]采用PCR方法对2015—2017年吉林省484份猪血清样品进行PCV3检测，PCV3阳性率为28.1%。刘东旭等[33]采用PCR方法对吉林部分地区10家规模化猪场704份样品进行PCV3检测，PCV3阳性率为34.2%，PCV3和PCV2混合感染率为22.7%。王会杰等[34]采用PCR方法对河北省2014—2018年209份病料样品进行PCV3检测，PCV3阳性率为34.2%，PCV3和PCV2混合感染率为19.61%。钟顺平等[35]采用PCR方法对云南省勐腊县86份样本进行PCV3检测，PCV3阳性率为17.44%，PCV3和PCV2混合感染率为15.12%。何长生等[36]采用荧光PCR方法对2018年安徽省3个地区12个猪场239份扁桃体样品进行PCV3检测，PCV3阳性率为14.6%，PCV3和PCV2混合感染阳性率为5.0%。段群棚等[37]采用PCR方法对2017—2019年广西482个规模猪场917份病猪样品进行PCV3检测，PCV3阳性率为15.81%，PCV3和PCV2混合感染率为11.72%。李静等[38]采用PCR方法对新疆6个地区449份猪全血或组织样品进行PCV3检测，PCV3阳性率为14.5%，PCV3和PCV2混合感染率为15.4%，PCV3和PRRSV混合感染率为16.9%，PCV3、PCV2和PRRSV三重混合感染率为15.4%，PCV3、PCV2、PRV、PRRSV四重混合感染率为1.5%。以上流行病学调查表明，PCV3在我国不同地区均有一定的流行率，但不同地区阳性感染率差异较大，且PCV3和PCV2、PRRSV等致病原的混合感染情况较严重，应加强混合感染的防控。

3 结语

近年来，PCV3的流行增加了PCV2综合防控的难度，鉴于过去PCV2给我国养猪业造成的巨大危害，当前提高PCV3的实验室检测能力，掌握不同地区PCV3的感染情况对PCV3的综合防控至关重要。在PCV3的各种检测方法中，PCR方法最简单、最便捷，但其敏感性低于套式PCR方法和荧光PCR方法，且PCR方法需要核酸电泳，造成了溴化乙锭（EB）对环境的污染；套式PCR方法的敏感性提高，但需要二轮PCR扩增反应，检测时间增加；荧光PCR方法敏感性大幅提高，且不需要核酸电泳，但其检测所需仪器设备、检测成本提高；LAMP和RRA等温扩增方法虽然不需要昂贵仪器设备，但引物设计较难，且检测过程中容易产生污染，出现假阳性；ELISA和胶体金免疫层析等免疫学方法检测快速、高通量，但具有一定的滞后性，无法对疫病早期或潜伏感染期进行诊断。在PCV3的感染现状方面，我国不同地区均存在PCV3的流行，但不同地区阳性感染率差异较大，且存在PCV3和PCV2、PRRSV等致病原的混合感染。总之，PCV3作为近年来新发的一种病毒病，其各种检测方法均具有自身的优势和缺点，不同实验室可根据自身条件选择自己适合的检测方法，同时PCV3在我国已经具有一定的流行率，应逐步加强PCV3的综合防控措施。