血清IgG糖基化修饰特征与自身免疫性疾病关系及其检测方法的研究进展

陈妍雯 袁舒颖 张春玲 邹琳 芦鑫荣 刘瑞杰 张绍兴 陈力 孙桂芹

318000浙江省台州市中心医院（台州学院附属医院）（张春玲）

200032上海 复旦大学基础医学院（邹琳 芦鑫荣 陈力）

自身免疫性疾病（AID）指机体免疫系统在环境或遗传等因素影响下，对自身成分发生强烈免疫应答而引起自身组织器官损害的疾病，其主要病因是自身抗体产生和免疫调节异常［1］。目前常见的AID有系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿关节炎（RA）、干燥综合征（SS）等。自身抗体是由自体细胞产生的针对组织器官的抗体，正常人体内存在自身抗体的含量较低，当体内的自身抗体含量超过阈值时，会对组织器官造成损伤［2］。多数自身抗体是免疫球蛋白G（IgG），IgG是血清中重要的糖蛋白。糖基化是蛋白质非常重要的翻译后修饰，可影响蛋白功能，如促进细胞生长、免疫耐受及产生免疫炎症反应等，在生命体的多种生物过程中有重要意义［3-4］。研究表明，自身免疫性疾病SLE、SS、RA等患者血清抗体IgG表现为异常糖基化［5-7］。本文阐述IgG的糖基化类型、糖基化对IgG功能的影响、常见自身免疫性疾病IgG的糖基化改变、参与糖基化修饰相关的基因及目前IgG糖基化检测的主要方法，为IgG糖基化与自身免疫性疾病的研究提供思路。

1 IgG糖基化修饰

蛋白质糖基化是一种寡糖与蛋白质上的氨基酸残基以共价键方式连接的修饰方法，由一系列糖基转移酶、糖苷酶控制［8］。蛋白质糖基化类型，主要包括N-糖基化和O-糖基化。N-糖基化是寡糖与多肽链上的天冬酰胺（Asn）连接，N-糖基化位点的氨基酸特征序列为Asn-X-Ser/Thr（X代表除脯氨酸外的任一氨基酸；Ser：丝氨酸，Thr：苏氨酸），真核生物中最为常见。O-糖基化中寡糖的连接位点为Ser或Thr，糖基化位点无特征性氨基酸序列［9-10］。

IgG是具有抗体活性的糖蛋白，主要存在血清中。IgG-Fc段的CH2含有保守的N-糖基化修饰位点Asn-297；而Fab段糖基化修饰发生在IgG可变区，糖基化多变性强，研究较难。根据IgG上Asn-297位点连接的寡糖类型，糖链分为G0型糖链、G1型糖链、G2型糖链。G1型较G0型在糖链末端多一个半乳糖；根据半乳糖连接的N-乙酰葡萄糖胺的不同，G1型又分为G1a型、G1b型；G2型糖链末端有两个半乳糖。

2 IgG糖基化修饰及其功能

IgG-Fc段的N-糖基化可影响其理化性质。AOYAGI等［11］报道IgG-Fc段的寡糖链可维持抗体四级结构以及Fc段的热稳定性，在一定程度上调节抗体效能。末端糖基与IgG-Fc段的溶解性相关，糖链末端半乳糖能使氨基酸残基的水溶性减弱，糖链末端唾液酸能使氨基酸残基的水溶性增强［12］。

IgG-Fc段的N-糖基化参与调节免疫系统。AOYAMA等［13］发现IgG-Fc段N-寡糖Man α-1-6分支链上的半乳糖，能增强IgG和FcγR受体的亲和力，导致抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）。IgG-Fc段N-寡糖的末端半乳糖化，还可促进抗体与血清补体C1q结合，激发补体依赖的细胞毒作用（CDC）。末端唾液酸化、核心岩藻糖基化水平下降，甘露糖基化和平分型N-乙酰氨基葡萄糖水平上升，均可增强ADCC效应［5］。另外，IgG-Fc段的N-糖基化可能与个体衰老有关。HAAN等［14］和YU等［15］报道自新生儿期开始，IgG的唾液酸化水平，随年龄增加而降低。

3 临床常见自身免疫性疾病患者血清IgG的糖基化

研究表明，多种自身免疫性疾病患者血清总IgG或特异性自身抗体，IgG-Fc段N-寡糖结构发生一定变化［5］。IgG的糖基化水平与自身免疫性疾病的相关机制尚未明确，但与炎症发生的相关机制已有报道。IgG-Fc段N-寡糖结构改变，影响IgG与FcγR受体或C1q补体亲和力，导致炎症反应的发生。经查阅文献，对常见自身免疫性疾病的血清IgG糖基化情况进行统计，并对常见自身免疫性疾病相关联的糖基化异常进行比较分析。综合结果显示，IgG含有半乳糖的糖链含量下降，可能是自身免疫性疾病的共有特征。HT患者IgG糖链中，末端半乳糖化糖型降低但唾液酸化糖型增高，提示该疾病可能与唾液酸糖苷酶相关。

3.1 半乳糖基化 MATSUMOTO等［16］报道RA自身特异性抗体类风湿因子（RF）的半乳糖基化水平下降，会增强RF活性，可能加重关节炎症。GEIJN等［17］报道认为，提高RA患者的雌激素水平，使血清总IgG的半乳糖基化水平上升，关节炎症减轻，疼痛感减弱。FRANO等［18］发现SLE患者半乳糖基化水平下降的IgG与甘露糖结合凝集素的亲和力增加，激活凝集素补体途径；与C1q的亲和力减弱，抑制经典补体途径，从而减弱自身抗原清除能力，提示其具有一定促炎活性。BOND等［6］发现与健康人相比，SS患者与RA患者血清IgG的GlcNAc水平差异无统计学意义，而GlcNAc在RA患者中高于健康人水平，半乳糖与GlcNAc的相关性可能与疾病种类有关。SHINZAKI等［19］分析炎症性肠病患者血清IgG，发现G2型糖链减少，而G0型糖链增多，G0/G2的比值越大病情越严重，G0/G2值可用于该疾病的临床诊断。然而，有研究称血清总IgG半乳糖基化水平下降，其与FcγRIIIa、FcγRIIIb受体的亲和力减弱，导致ADCC效应降低，与C1q补体的亲和力减弱，导致CDC效应降低，有一定抗炎活性［20］。

3.2 唾液酸化 研究表明，IgG-Fc段N-寡糖末端唾液酸化，与其抗炎和促炎活性有关［21］。ZĄBCZYŃSKA等［22］分析HT患者血清IgG的N-寡糖，与唾液酸特异性结合凝集素的反应增强，表明唾液酸化水平升高，与FcγR受体亲和力降低，ADCC效应减弱，可能有一定的抗炎作用，但唾液酸化与HT的关系还未明确［23］。PAGAN等［24］对关节炎小鼠输注唾液酸转移酶，提高血清总IgG唾液酸水平，小鼠关节的炎症渗入减少、组织破坏程度减轻。ENGDAHL等［25］发现雌激素治疗RA患者能使其唾液酸转移酶活性增加，血清IgG唾液酸化水平上升，关节炎症减轻。上述研究提示，IgG末端唾液酸化，与其抗炎活性有关。WUHRER等［26］检测GPA患者血清的总IgG唾液酸化水平下降，与FcγRIa、FcγRIIIb的亲和力增强，加强ADCC效应；自身特异性抗体抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）唾液酸水平下降，激活细胞因子γ-干扰素、粒细胞集落刺激因子，从而引起炎症。CHENG等［27］报道JIA患者血清IgG的唾液酸水平降低，与B细胞表面IgG-Fc受体样蛋白5（FcRL5）亲和力高，激活B细胞相关免疫反应，导致炎症发生。

3.3 核心岩藻糖基化 已有报道［28-29］，RA患者ACPA中的核心岩藻糖基化水平随着关节炎的发展而上升，但对IgG介导的Fc受体、补体相关炎症作用机制尚未明确。SHIELDS等［23］通过中国仓鼠卵巢细胞获得Fc段Asn297无核心岩藻糖的IgG，发现其与FcγRIIIa的亲和力增加，ADCC效应增强。另外，GUO等［30］发现随着用卵清蛋白诱导小鼠免疫次数增加，IgG含量升高，且IgG Fc段核心岩藻糖基化水平越高，IgG岩藻糖基化水平的上升，可能由于多次免疫诱导抗原特异性B细胞的增殖和分化。

3.4 甘露糖基化 YUAN等［31］报道HT患者的TgAb-IgG的甘露糖基化水平升高，根据患者血清TgAb水平分为高组和中等组，并纯化得到两组等量TgAb-IgG，分析发现高组的TgAb-IgG的甘露糖基化水平高于中等组。SLE患者血清总IgG的甘露糖基化水平与健康人差异无统计学意义［32］。然而，GREEN等［33］建立α-甘露糖苷酶II基因突变小鼠模型，使小鼠血清IgG甘露糖基化水平上升，并出现人SLE样肾小球肾炎，提示IgG甘露糖基化可能与SLE有一定关联。ZHOU等［34］为研发抗体建立小鼠模型，发现IgG末端高甘露糖基化水平上升，使IgG与FcγRIIIa受体亲和力增加，从而增强ADCC效应。BOUNE等［35］提出IgG甘露糖分子数增多常伴有末端半乳糖缺失，甘露糖基化IgG的促炎活性需结合半乳糖基化水平分析。另外，缪金升等［32］报道，RA患者血清RF的高甘露糖型糖链降低，且与健康人相比，差异有统计学意义。上述研究表明，IgG的甘露糖基化修饰水平与自身免疫性疾病的关系有待更深入的研究。

4 自身免疫性疾病与糖基化相关基因的研究

人类基因组中约有2%的基因编码糖基化相关蛋白，且其中60%编码糖基化相关蛋白的基因与N-糖基化相关［36］。IgG糖基化受糖基转移酶和糖苷酶基因的调控，并影响IgG的结构和功能。GALLO等［37］发现SS患者半乳糖转移酶相关基因B4GALT1、B4GALT2、B4GALT3、B4GALT16表达水平降低，可能导致寡糖链末端半乳糖水平下降；唾液酸转移酶相关基因ST8SIA4表达增加，可能导致寡糖链末端唾液酸水平上升。

此外，LAUC等［38］分析各种自身免疫性疾病中，与IgG糖基化水平相关基因的表达情况，其中与编码糖基转移酶相关的基因有：B4GALT1（编码β-1，4-半乳糖基转移酶1）、ST6GAL1（编码ST6 β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶1）、FUT8（编码岩藻糖基转移酶8）和MGAT3（编码β-1，4-甘露糖基糖蛋白4-β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶）；另外报道与糖基化有关联的基因，在自身免疫性疾病中表达发生变化，RA相关基因IL6ST-ANKRD55（编码IL-6信号转导因子-锚蛋白重复结构域55，与半乳糖基化相关）表达下降；SLE相关基因IKZF1（编码IKAROS家族锌指1蛋白，与核心岩藻糖基化有关）表达下降；CD相关基因IKZF1表达上升；UC相关基因LAMB1（编码层粘连蛋白亚基Beta1，与核心岩藻糖基化有关）表达下降。

5 IgG糖基化的检测方法

标准化的糖基化检测方法，是糖组学研究的重要基础，可为自身免疫性疾病与糖基化的研究提供技术。目前通用的糖蛋白寡糖分析，是先经N-糖苷酶水解制备糖链，再经质谱、毛细管电泳、色谱等技术分析制备样品中的糖链结构。

5.1 蛋白糖链制备 糖蛋白糖链制备的方法为酶切法和化学水解法。其中酶法特异性较好，过程中糖链结构稳定，较为常用。根据酶切体系中反应流程的不同设计，酶切法可分为N-糖苷酶单酶切法和糖苷酶/N-糖苷酶序贯酶切法。（1）N-糖苷酶单酶切法（PNGase Assay）：1984年，PLUMMER等［39］发现了细菌中第一个N-糖苷酶F（PNGase F）。PNGase F具有广泛的底物特异性，能水解并释放糖蛋白上完整的N-糖链，是经典的糖蛋白糖链制备方法。但PNGase F不能作用于植物和昆虫来源的含有α-1，3核心岩藻糖的N-糖蛋白。2015年，SUN等［40］发现第二种细菌来源的N-糖苷酶PNGase F-Ⅱ。PNGase F-Ⅱ为广谱N-糖苷酶，在具有PNGase F功能的同时，还可水解释放含有α-1，3核心岩藻糖的N-糖蛋白的完整糖链，为糖链的制备，提供了一种新的途径和方法。（2）糖苷酶序贯酶切法（Cut-Heat-Cut Assay）：PNGase单酶切分析法操作简便，但对解析糖链上各个糖的连接排列方式存在一定局限性。在此方法的基础上，复旦大学上海医学院陈力课题组建立了多酶切制备分析法，即样本先经特定糖苷酶酶切并加热去酶活后，再行PNGase酶切。利用这一流程，通过对比分析糖图谱，可以解码糖链结构的细节，该方法于2019 年被正式命名为 Cut-Heat-Cut Assay［41］。Cut-Heat-Cut Assay是对PNGase单酶切分析法的一个重要补充。利用这一新的方法，LI等［42］发现第一个糖蛋白核心岩藻糖苷酶（cFase I），HOU等［41］发现第一个糖蛋白核心木糖苷酶（gpcXase I）及第一个细菌脱敏操纵子。糖苷酶/N-糖苷酶序贯酶切法可以为糖链解码提供一种新的策略。

5.2 糖链检测 （1）质谱法：利用质谱（MS）技术检测糖链，首先将样品糖蛋白上的糖链分离下来，不同结构的糖链在电场中带上不同量的电荷，根据质谱峰的分子量判断糖链结构，根据峰高分析同种糖链的含量。1988年Karas等首次用激光解析电离质谱（LDI-MS）分析全血清聚糖谱［43］。在LDI-MS的基础上，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）于样本中添加基质，由基质从激光中吸收能量，根据分子在电场作用下到达检测器的时间来测定离子质荷比，是目前糖组学领域广泛应用的方法。（2）液相色谱法：液相色谱法包括高效液相色谱法（HPLC）、超高效液相色谱法（UPLC）和亲水作用液相色谱法（HILIC）等，均通过色谱柱分离样品并鉴定。UPLC较HPLC的色谱柱粒径更小，利于物质分离且检测更为灵敏，具有分离糖异构体和分析相对丰度的能力［44］。HILIC采取递减有机溶剂比例的梯度进行洗脱，对人血清IgG、RNase B和胎球蛋白的寡糖有较好的分离度［45］。另外，液相色谱法与质谱技术联用，可将灵敏度提高至纳克水平［46］。（3）毛细管电泳法（CE）：CE分析糖链是利用发生硫酸化、糖基化的糖链会带有负电荷，可在电场中发生分离［47］。所需的进样量少，标本检测灵敏度更高，但电渗作用会因样品组成而变化，对分离的重复性有一定影响。LIU等［48］使用CE分析肝细胞癌患者血清糖蛋白上的N-糖链，发现α1酸性糖蛋白上的α（1，3）-岩藻糖三触角糖链增多，带有平分型β-N-乙酰葡萄胺的糖链减少。（4）核磁共振波谱法：核磁共振波谱（NMR）是使物质在跃迁中产生能量差，表现出共振谱达到检测鉴定的方法。糖蛋白寡糖链上不同的糖基会释放不同的信号，若糖基发生位移，在NMR光谱中会显示为不同位置的识别信号峰。目前可检测糖链中糖基的连接顺序、糖苷键的种类与糖链的立体构型［49］。由不同糖苷键连接的甘露糖，其信号峰在位置和强弱上都有差异［50］。

6 小结与展望

糖基化是蛋白质重要的翻译后修饰之一，对糖蛋白的结构和功能有一定影响［5］。血清IgG和自身抗体均为糖蛋白，且自身免疫性疾病的患者血清IgG和自身抗体Fc段上不同类型糖基化水平存在升高或降低。血清IgG的N-糖基化修饰，与抗体依赖细胞介导的细胞毒作用、补体依赖的细胞毒作用等炎症途径的激活或抑制相关。IgG糖基化与自身免疫性疾病的相关性有待进一步探究。自身免疫性疾病患者IgG发生糖基化改变，部分伴有糖苷酶或糖基转移酶相关基因的表达上调或下调，提示可以从糖基化相关基因的角度，探索自身免疫性疾病发生的机制。

随着糖基化分析技术的不断发展，对IgG N-糖基化与自身免疫性疾病的关联有了更多认识，并逐渐成为研究关注的热点。目前用于糖基化分析的检测技术有质谱法、液相色谱法、毛细管电泳法及核磁共振波谱法等，这些技术为从糖基化角度研究自身免疫性疾病的致病机制，提供技术手段。血清IgG的N-糖基化水平，与自身免疫性疾病进程有一定关联性，可能成为自身免疫性疾病的潜在生物标志物，为诊断、治疗预后提供参考，也给疾病的发病机制和药物研究带来重大意义。