肝癌微环境靶向与免疫治疗的研究现状

朱明强， 丁佑铭

武汉大学人民医院 肝胆外科， 武汉 430060

肝癌恶性程度高，预后差，是全球死亡率第三位、发病率第四位的常见恶性肿瘤[1]。目前，肝癌治疗的首选治疗方法仍是肝切除术和肝移植，但术后的复发率高。肝癌表型和分子异质性使其对常规化疗和靶向治疗具有高度耐药性。失去手术机会的肝癌复发患者往往缺乏有效的治疗方法。肝癌细胞与其微环境之间的相互作用已成为当前研究的热点。肝癌微环境主要由肿瘤细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltration lymphocytes,TIL)、肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAF)、肝星状细胞(HSC)、肿瘤相关中性粒细胞(tumor-associated neutrophils，TAN)、内皮细胞等细胞组分以及细胞外基质(ECM)、细胞因子、趋化因子、蛋白质和蛋白水解酶等非细胞成分构成[2]。TIL包括肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAM)、T淋巴细胞、B 淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)和髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)和发挥抗原呈递作用的树突状细胞(DC)等，参与肿瘤免疫反应，调控肿瘤生长、转移[3]。TIL的细胞亚群具有促肿瘤和抗肿瘤的双向作用，靶向肝癌微环境治疗肝癌越发被关注。免疫治疗可激发肿瘤特异性免疫，打破免疫耐受来识别并杀伤肿瘤细胞，进而延缓肿瘤进展。本文将阐述肝癌肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)的特征、TME组分在肝癌进展中的作用以及靶向TME治疗的研究进展。

1 肝癌微环境的特征

肝癌微环境的特征包括：(1)缺氧。缺氧是所有实体瘤的共性，缺氧诱导因子(HIF)信号通路参与炎症反应、免疫抑制、激活多种促癌生物效应。HIF可导致调节性T淋巴细胞(Treg)与巨噬细胞聚集，促进索拉非尼耐药，是肝癌诊断、预后和复发的潜在生物标志物[4]。(2)免疫抑制。细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)、NK细胞和单核细胞发挥抗肿瘤作用。TAM、MDSC和Treg介导了免疫抑制的TME，帮助肿瘤细胞免疫逃逸，促进肝癌的恶性发展。(3)炎症反应。炎症环境利于循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)转移的播种存活和增殖转移。肿瘤细胞Toll样受体信号通路上调IL-6的表达和缺氧促进了肿瘤的炎症反应，促进肿瘤抵抗、增殖和侵袭[5]。(4)血管生成。CAF释放基质细胞衍生因子、促血管生成因子等，促进肿瘤生长和血管新生，导致肝癌晚期转移。(5)淋巴管生成。淋巴道是肿瘤转移的主要途径之一，淋巴管生成是肿瘤转移的重要基础。临床资料表明，肿瘤源性血管内皮生长因子(VEGF)-A/D诱导局部淋巴管转移，并与局部淋巴管转移有关[6]。(6)亲器官性。肝癌转移多见于肝内转移和肺转移，这可能与肿瘤来源的炎性因子改变定植部位黏附分子和ECM成分有关。富集不同分子和细胞成分使肿瘤转移具有不同亲器官性。(7)异质性。免疫和药物等多种刺激使肝癌微环境产生瘤内异质性。当微环境细胞死于凋亡，癌细胞前体发展成肝癌。当周围细胞死于坏死，前体细胞发展成肝内胆管癌[7]。肝癌微环境在不同空间具有异质性，即形成热肿瘤和冷肿瘤。单中心起源的多发性肝癌，微环境巨噬细胞多，异质性弱；多中心起源，微环境CD8+T淋巴细胞多，微环境间异质性强[8]。原初肿瘤与次生肿瘤基因与表型也不同。早期复发肝癌表现为Treg细胞减少，DC和CD8+T淋巴细胞增加，CTL处于低细胞毒性和低耗竭状态[9]。(8)可塑性。上皮-间充质转化和典型干细胞脱分化状态等机制参与可塑重编程，这是侵袭性和化疗抵抗的驱动因素。癌细胞状态对TME的反应是可塑的，改变TME可以将肿瘤细胞从一种状态驱动到另一种状态，药物敏感性也随之改变。

2 TME与肝癌的发生发展

2.1 HSC和CAF HSC紧贴着肝窦内皮细胞和肝细胞，是ECM的主要来源。正常情况下HSC处于静止状态，肝损伤时HSC激活为肌成纤维细胞，在肝癌发展过程中，经EMT和TGFβ的作用可有效转化生成CAF[10]。活化的HSC与免疫细胞相互作用，抑制T淋巴细胞的增殖及促进肝癌发展及肝癌切除术后早期复发[11]。HSC通过PGE2破坏 NK 细胞功能以及抑制HSC诱导的MDSC在肿瘤组织中蓄积从而抑制肝癌的生长[12]。HIF-1α、TGFβ、外泌体等可以诱导CAF细胞FAP和α-SMA的表达[13]。CAF活性受肿瘤细胞分泌的生长因子调控，CAF激活后可以自身分泌趋化因子，诱导ECM各细胞类型的募集，构成ECM成分，促进肿瘤血管生成。Ji等[14]发现手术切除残存结直肠肿瘤组织可释放携带整合素β亚基样蛋白1的胞外囊泡，激活NF-κB信号通路促进CAF转化，进而促进癌细胞的肝转移。

2.2 肿瘤浸润性淋巴细胞

2.2.1 肿瘤相关巨噬细胞(TAM) TAM可分为M1经典激活型和M2替代激活型。M1型巨噬细胞抑制肿瘤、促进炎症及发挥免疫活性作用，M2型巨噬细胞则起到组织修复、免疫逃逸及促进肿瘤进展。有研究[15]发现一种新型的“生化开关”，从糖酵解途径分支出来，为快速细胞增殖和分化提供原材料，抑制该途径可抑制M2极化和增殖。同时，SHH-Hedgehog信号轴可促进TAM极化来抑制CD8+T淋巴细胞的增殖[16]。TAM中RIPK3的缺乏通过重编程代谢，促进脂肪酸氧化以及诱导M2极化，地西他滨调节脂肪酸代谢和增强TAM的抗肿瘤免疫来治疗肝癌[17]。Sharma等[18]研究表明胚胎肝脏发育与肝癌生态系统之间存在一个共享程序，即胎-瘤重编程。TAM及相关因子能促进肝癌的侵袭和转移，导致肝癌进展和肝切除术后复发，降低术后生存率和无病生存率[19]。

2.2.2 肿瘤相关淋巴细胞 CTL细胞接受CD4+辅助性T淋巴细胞(Th)的指令来识别异常细胞和激活细胞毒活性。高活化DC能为CTL提供IL-15、CXCL16等生存信号，帮助CTL在TME中聚集，使CTL能够存活足够长的时间以有效地消除癌细胞[20]。实体肿瘤内抗肿瘤T淋巴细胞浸润极少，而浸润的T淋巴细胞以促肿瘤的Th2和Treg为主。Huang等[21]发现IFN-STAT1通路转录上调了RGS1，RGS1抑制了CTL和Th1细胞迁移至肿瘤的能力。在代谢物缺乏等条件下，Treg细胞通过剥夺效应T淋巴细胞的营养、替代代谢物乳酸和增强氧化应激损伤抵抗力帮助肿瘤免疫逃逸。Treg免疫抑制并非传统的抑制因子的表达，而是通过CD39/73的释放并将ATP转化为腺苷，氧化应激引发的Treg细胞凋亡降低了阻断PD-1介导的抗肿瘤治疗效果[22]。B淋巴细胞产生的抗体可通过抗体依赖性细胞毒作用、补体激活和增强DC抗原呈递等促进抗肿瘤免疫。B淋巴细胞有助于肿瘤相关三级淋巴结构的形成，这支持肿瘤特异性B淋巴细胞的进一步成熟和亚型转换，以及肿瘤特异性T淋巴细胞反应的发展。肿瘤浸润性B淋巴细胞发挥促肿瘤和抗肿瘤作用取决于TME的组成、B淋巴细胞表型及其产生的抗体。

2.2.3 NK细胞 NK细胞属于天然淋巴细胞，通过穿孔素/颗粒酶的胞吐作用、结合FASL/RAILR和分泌IFNγ、TNFα非特异性直接杀伤肿瘤细胞。根据CD56的表达可以将NK细胞分为两个亚群：CD56dim和CD56bright。CD56dim亚群是成熟的细胞毒性细胞，占血液中的大多数；CD56bright亚群则并不成熟，细胞毒性较小，位于次级淋巴器官，负责免疫调节[23]。NK细胞在TME中浸润少，细胞功能明显被抑制。NK细胞亚群的迁移受趋化因子和趋化因子受体表达谱的调控。肝内CD56+NK细胞表达多种趋化因子受体CCR5和CXCR6，其参与NK细胞在肝脏的驻留[24]。TME能够改变局部趋化环境，优先招募细胞毒性较小的NK细胞。果糖-1,6-二磷酸酶通过抑制NK细胞糖酵解代谢从而削弱NK细胞功能，腺苷可以限制NK细胞的成熟和功能，所以，灵活底物提高细胞毒性免疫细胞的代谢能力是一种有前途的治疗策略[25]。

2.2.4 髓源性抑制细胞(MDSC) MDSC是一群由分化状态各异的不成熟髓源性组成的异质性群体，可发挥免疫抑制功能，包括抑制T淋巴细胞激活、使激活的T淋巴细胞失能、抑制NK细胞的细胞毒性、使巨噬细胞向促进肿瘤生长的表型极化等。MDSC由共同髓系祖细胞发育而来。MDSC可分成两大亚群：单核MDSC和多核MDSC。MDSC在正常状态下分化为巨噬细胞、粒细胞和DC细胞，在炎症、肿瘤等疾病状态下迅速扩增，分化为免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞[26]。MDSC竞争性消耗微环境半胱氨酸，上调iNOS和ARG-1，使T淋巴细胞生成受阻以及诱导Treg扩增来增强负调控作用，通过产生ROS下调NKG2D的表达，抑制 NK 细胞的功能[27]。在单核MDSC中还发现KRAS突变抑制IRF2，导致CXCL3的抑制被解除，可召集MDSC抑制杀伤性T淋巴细胞[28]。

2.2.5 树突状细胞(DC) DC是目前功能最强的抗原呈递细胞，体内DC多处于非成熟状态，具有极强的抗原内吞能力。DC除激活T淋巴细胞抗肿瘤外，还能刺激B淋巴细胞成熟和Th细胞、NK细胞活化。DC传统上分为cDC1和cDC2。cDC1由髓样干细胞在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的刺激下分化而来，也称为髓样DC；cDC2源于淋巴样干细胞，与T淋巴细胞和NK细胞有共同的前体细胞，也称为淋巴样DC；DC经主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ/Ⅱ类途径呈递捕获的抗原，同时诱导共刺激信号B7/CD28等充分活化CTL来发挥抗肿瘤免疫反应[29]。关于DC传递抗原的形式，众说纷纭。有研究[30]认为DC通过外泌体囊泡激活T淋巴细胞。在肝癌中，存在一群表征特殊的LAMP3+DC，主要表达CD80/83、CCR7 等与成熟和细胞迁移有关的基因，具有向肝淋巴结迁移的潜在能力。LAMP3+DC可吸引T淋巴细胞，通过CD86-CD28作用于Treg亚群、CD86-CTLA4作用于耗竭性T淋巴细胞亚群[10]。

2.3 肿瘤相关中性粒细胞(TAN) 肿瘤组织产生趋化因子,中性粒细胞在趋化因子的作用下通过血管壁进入肿瘤组织，这些浸润的中性粒细胞即TAN。TME可通过释放趋化因子CXCL1/2/5/6/8、CCL3/5与CXCR1/2结合趋化外周血中的中性粒细胞到达肿瘤局部微环境中[31]。TAN具有双重作用，通过驱动血管生成、ECM重构和免疫抑制等发挥促瘤生长作用，通过产生ROS、RNS或直接杀死肿瘤细胞等方式介导抗肿瘤反应。在IFNβ、IL-1β等作用下，中性粒细胞向N1极化。N1型为短寿命、成熟型、高毒性，可促进CTL活化。在 TGFβ、IL-6/7/8作用下，中性粒细胞向N2极化，N2型为长寿命，不成熟型，低毒性，促进肿瘤的生长及转移[32]。中性粒细胞-淋巴细胞比值是反应免疫系统功能的一项指标，是影响肝癌患者预后的独立因素[33]。循环肿瘤细胞-中性粒细胞簇与循环肿瘤细胞相比，细胞周期和DNA复制通路基因明显上调，细胞增殖加快，循环肿瘤细胞的转移潜能提升[34]。

2.4 肿瘤血管内皮细胞 肿瘤血管的生成以从头生成和血管芽生为主。血管生成的过程包括启动、增殖和迁移、成熟。影响血管生成的因素主要包括：(1) HIF-1。(2)促血管生成因子，如VEGF、血小板衍生生长因子等。(3)抑制血管生成因子，如血管生成抑素、内皮抑素等。(4)ECM，有胶原蛋白，层粘连蛋白等。缺氧使SDF1和CXCR4在血管内皮细胞上调，诱导肿瘤细胞与血管内皮细胞的黏附，刺激肿瘤细胞跨内皮迁移[35]。VEGF是最强的促血管生成因子，可招募TAM间接刺激血管生成。Zhang等[36]发现DLL1可通过激活CD8+T淋巴细胞来诱导长效肿瘤血管正常化，进而创造一个促进抗肿瘤免疫反应的微环境。Zhao等[37]证实CDP-二酰基甘油合成酶-2(CDS2)基因缺失，将VEGFA信号传导的输出从促进血管生成切换到诱导血管退化，这其实是取决于特定的内皮代谢状态和信号传导的相互交流。

2.5 TME非细胞组成 ECM 由胶原蛋白、蛋白多糖、层粘连蛋白和网络连接蛋白等组成，为肿瘤细胞提供生化成分和基本结构支持，还负责细胞间通讯、参与细胞增殖和黏附。胶原沉积和成纤维细胞浸润导致结缔组织增生，与患者预后不良密切相关。肝癌细胞通过趋化因子的作用可促进肝癌进展。缺氧条件下的糖酵解活性增强会增加乳酸的积累，乳酸脱氢酶与肿瘤大小和临床严重程度呈正相关。乳酸可通过降低T淋巴细胞增殖、IFNγ的产生来抑制效应T淋巴细胞功能，同时，低pH可显著促进DC分化，这些细胞减少葡萄糖消耗，上调线粒体呼吸基因和抑制mTORC1活性。低糖诱导FOXP3的表达，增加T淋巴细胞从效应T淋巴细胞向Treg的分化。糖酵解代谢的加速增加了肿瘤源性GM-CSF的产生进而促进MDSC的浸润。脂质、脂肪因子可促进肿瘤细胞的黏附、迁移和侵袭，影响肿瘤恶性进展[38]。

3 靶向肝癌微环境治疗

3.1 靶向TME组分

3.1.1 靶向CAF 靶向CAF方法包括杀伤CAF、抑制CAF活化、干扰CAF功能。以纳米载体靶向细胞毒性药物(吖啶黄、紫杉醇)和肿瘤疫苗可选择性杀伤CAF[39]。通过阻断TGFβ/Smad/ROS激活信号、逆转表型可抑制CAF的活化[40]等。抗纤维化药物、细胞因子阻滞剂可干扰CAF细胞因子的分泌。有研究[41]以脂质体为载体递送质粒DNA和siRNA，阻断CAF与肿瘤细胞Wnt信号和CXCL1的信息交流，抑制了IL-6、粒细胞集落刺激因子产生，抑制了肿瘤的进展，通过阻断CAF分泌囊泡是治疗肝癌耐药的一种方法。

3.1.2 靶向慢性炎症 TAM通常表现出M2样表型，靶向M2细胞或将M2重编程为M1细胞可抑制肝癌进展。CSF-1是TAM主要调节因子，在肿瘤细胞含量高多提示预后不良。CSF-1R激酶抑制剂BLZ945减少M2型极化，阻止肿瘤进展并改善小鼠的存活率[42]。GM-CSF可刺激TAM和DC的抗原呈递，进而刺激抗体依赖性细胞毒作用。肝癌细胞TAM增多与血管侵犯、卫星灶、淋巴结转移呈正相关，术后生存率降低[43]。TAN是不良的预后指标,靶向TAN能抑制肿瘤进展。TGFβ调节TAN的促肿瘤和抗肿瘤双重表型，因此，TGFβ和趋化因子的阻断可能是潜在的有效治疗策略。细菌外膜囊泡包被纳米颗粒形成仿生纳米病原体(NPN)，携带此病原体的中性粒细胞可主动趋化至光热治疗的炎症肿瘤部位，中性粒细胞胞膜破裂使释放出的NPN通过其包载的顺铂有效杀死残存的肿瘤细胞，达到完全清除肿瘤的效果[44]。

3.1.3 靶向肿瘤血管生成 血管生成和抗血管生成分子介导的信号不平衡导致血管异常，使肿瘤逃避免疫系统的攻击，其中，VGEF和血管生成素-2可见明显升高。目前有许多的血管生成抑制药物被批准用于临床治疗。抗VEGF-VEGFR药物大致包括以下几类：直接靶向VEGF和VEGFR蛋白的抗体药物，例如贝伐单抗等；酪氨酸激酶信号通路抑制剂，例如索拉非尼等；还有融合蛋白以及免疫调节剂等类型的药物。结合临床可以发现，血管生成抑制剂的临床效益其实并不明显，有治疗局限性，而原因可能是因为调控血管生成网络，涉及多个蛋白或信号通路，单靶药物抑制某一蛋白后，血管生成出现代偿性现象以及肿瘤患者体内新生血管结构不完整，通透性较差，一些治疗药物也不能有效地达到病灶部位。

3.1.4 靶向细胞外组分 酸性条件使相关基因表达非正常剪接的蛋白质形式，帮助细胞迁移到血管，针对性降低局部酸度的方法可能干扰肿瘤生长和转移[45]。基于酸性pH开发选择性抗体及嵌合抗原受体T淋巴细胞(CAR-T)治疗技术更具靶向性，携带pH敏感信号的纳米成像诊治技术将开发出对肝癌更有效的纳米诊断和疗法。肝癌细胞来源的外泌体(EV)可触发HGF/c-Met/Akt信号通路，在抑制索拉非尼诱导的细胞凋亡和促进肝癌耐药方面发挥作用[46]。EV具有良好的生物相容性、低免疫原性和低毒性等优点，开发精确设计EV的方法将有助于EV抗肿瘤治疗。靶向代谢也为肿瘤治疗提供良好的方向。抑制糖酵解调节酶或使用竞争性葡萄糖类似物以及抑制脂肪酸合酶可用于肿瘤治疗，间接影响免疫细胞的功能，同时，靶向代谢通信应考虑肿瘤类型、分期、位置和潜在的补偿机制[47]。

3.2 免疫检查点抑制剂、肿瘤疫苗 目前上市的免疫检查点抑制剂主要是CTLA-4抑制剂和PD-1/PD-L1抑制剂。伊匹单抗是首个获美国食品药品监督管理局批准的CTLA4抑制剂。PD-1抑制剂有纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、卡瑞丽珠单抗；PD-L1抑制剂有阿替利珠单抗和度伐利尤单抗等；阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗在欧美和我国获批用于治疗既往未接受过系统治疗的不可切除肝癌患者，是晚期肝癌一线治疗的优选治疗方案。伊匹木单抗+纳武利尤单抗, 帕博利珠单抗已获批用于肝癌的二线治疗。目前，针对肝癌靶点的疫苗主要包括异种重组甲胎疫苗、DC疫苗和溶瘤病毒疫苗。成纤维细胞活化蛋白靶点的DNA疫苗可改变肿瘤间质，协同肿瘤抗原特异性DNA疫苗可提高抗肿瘤作用[48]。DC肿瘤疫苗将体外诱导或构建的可特异性识别肿瘤的DC细胞回输入肿瘤患者体内，激活T淋巴细胞对肿瘤的免疫反应。尽管DC疫苗在国内被提及的比较少，但国际上已有几款DC疫苗获批上市，用于乳腺癌、前列腺癌与肝癌的治疗。溶瘤病毒联合CAR-T疗法可弥补CAR-T单独作战的缺陷，在实体肿瘤治疗方面产生较强的协同效应[49]。

3.3 嵌合抗原受体T淋巴细胞(CAR-T) CAR-T是将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部与CD3或FcR的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者T淋巴细胞，使其表达嵌合抗原受体。“重编码”T淋巴细胞具有肿瘤特异性。肝癌过继细胞治疗常见的靶点包括：甲胎蛋白、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、黑色素瘤抗原基因-1/3、人端粒酶逆转录酶、VEGF、上皮细胞黏附分子、NK组2成员D配体等，相关靶点的CAR-T治疗肝癌的临床研究有相应的报道。在实体瘤中，过表达BATF转录因子可以阻断CAR-T的耗竭，增强CAR-T的增殖能力和毒性，并形成记忆细胞，提供长期的肿瘤治疗效果[50]。由于TME免疫抑制和物理屏障限制T淋巴细胞接触肿瘤细胞(运输和归巢)、肿瘤异质性和抗原丢失、工程T淋巴细胞扩增和持续性有限、抗原脱靶严重毒性反应等原因，肿瘤出现免疫逃逸以及导致复发或治疗无效。因此，联合免疫检查点抑制剂，局部经肝动脉给药等方法将能极大的提高过继免疫细胞治疗的疗效。联合治疗包括免疫+放化疗、免疫+靶向等。

4 小结

微环境细胞呈现连续、可逆、动态网络。开发新技术，明确微环境复杂的细胞成分及其作用、鉴定新亚群和新治疗靶点对更全面了解肝癌的发生发展机制具有重要意义。肝癌微环境的异质性和患者靶向与免疫疗法的不同响应率存在密不可分的关系，通过对肝癌免疫微环境进行分型，可以更好的指导临床治疗，实现精准医疗。随着对免疫检查点抑制剂、放化疗、肿瘤疫苗、过继免疫治疗、分子靶向药物以及联合治疗的进一步探索，针对肝癌微环境的更高效的肿瘤治疗方式及药物也会即将问世。在精准医学背景下，探索成熟的TME分型的临床分期系统，将有效评估、预测免疫治疗的疗效，促进肝癌精准医学治疗的发展。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：朱明强负责撰写论文；丁佑铭指导撰写文章并最后定稿。