唾液胃蛋白酶对胃食管反流病诊断的研究进展

赵 爽，张月寒，胡宵月，于亭亭，苏园园，郑吉敏

(1.河北北方学院 研究生学院，河北 张家口 075000；2.河北省人民医院 消化科，河北 石家庄 050051)

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease, GERD)临床表现多样，包括食管综合征和食管外综合征，这些表现可单独出现，也可伴随出现，食管综合征包括典型症状(反酸、烧心)和不典型症状(胸痛、吞咽困难等)。食管外反流在耳鼻喉科被称为咽喉反流(laryngopharyngeal reflux，LPR)，定义为胃内容物反流至上食管括约肌(upper esophageal sphincter，UES)以上部位(包括鼻腔、口腔、咽、喉、气管、肺等)的现象。咽喉反流性疾病(laryngopharyngeal reflux disease，LPRD)是胃内容物反流至UES以上部位引起一系列症状和体征的总称[1]。LPRD可表现为咽部不适、声音嘶哑、咳嗽、哮喘等症状，这部分患者常被误诊为呼吸系统或咽喉疾病而延误病情。由于反流病的非特异性症状，目前缺乏同时兼顾敏感性和特异性的诊断方法。在GERD患者中非糜烂性反流病( non-erosive reflux disease，NERD)比糜烂性反流病更常见，而NERD在胃镜下无食管炎表现，因此通过胃镜检查诊断GERD敏感性较低。目前GERD诊断的金标准是24hpH-MII，但它有一定的局限性。首先，一定比例的GERD患者无法通过24 h食管pH-阻抗监测(24 hours pH and multichannel intraluminal impedancemetry, 24hpH-MII)测量仪检测到，在反流监测期间改变饮食和限制活动可能导致假阴性结果；其次，有一些监测期间无症状的反流患者可能会错过反流相关症状的监测；第三，这是一种侵入性的、昂贵的技术，有一定比例的患者无法忍受这种监测[2]。对于LPRD患者，双腔pH阻抗探针为诊断的金标准，但目前该检查的规范性数据缺乏共识，并同时具有24hpH-MII的不足。临床中存在许多抑酸治疗无明显效果的患者，需要进一步明确病因。因此，在临床上开发一种无创、方便、有效、灵敏的诊断方法是非常必要的。

1 唾液胃蛋白酶检测对GERD的诊断价值

胃蛋白酶是一种蛋白酶，其前体胃蛋白酶原在胃主细胞中合成，分泌后在酸性胃液中激活，其中胃蛋白酶Ⅲ复合物占80%。胃蛋白酶在pH=2.0的环境中活性最高，在pH=6.5时失活，但能保持完整状态，当pH再次下降时其活性可恢复[3]。胃蛋白酶反流至食管和咽喉部时可长期滞留，直至下次反流发生时恢复活性，引起不适症状。正常情况下胃蛋白酶存在于胃和十二指肠中，若在唾液、痰液、支气管肺泡灌洗液、气管吸出液和中耳积液等检出胃蛋白酶，理论上可成为反流性疾病的客观诊断依据[4]，胃蛋白酶是一种与当前可用的GERD检查方法不同的非侵入性、易于执行和廉价的技术。其非侵入性也将极大的促进小儿GERD的诊断。因此，唾液胃蛋白酶有望成为GERD简单、无创的诊断方法。

目前检测唾液胃蛋白酶的方法包括酶联免疫吸附法、纤维蛋白原溶解检测法、蛋白印迹法以及Peptest检测法等。蛋白印迹法、纤维蛋白原溶解检测法为定性的检测方法, 酶联免疫吸附法、Peptest检测法可以定量，且较为常用。酶联免疫吸附法测定应用人胃蛋白酶检测试剂盒，依据说明书试验步骤配制标准品，加样，检测。与其他检测方法相比，Peptest方法具有简单易行、标准化的优点，在 Peptest试剂条的取样区滴加离心后的唾液上清液，15 min后即可得出胃蛋白酶定性检测结果，若配备相应的读取系统, 可定量测出唾液中的胃蛋白酶浓度[5]。

LPRD因为通常没有特定的症状、缺乏可靠的诊断方法使其诊断变得困难。耳鼻喉科医生诊断LPRD主要依赖症状以及喉镜检查。唾液胃蛋白酶作为一种简便经济的检查方法，其在诊断LPRD中的应用被广泛研究。有学者分别于2001年和2002年设计制定了反流体征评分量表(reflux finding score, RFS)和反流症状指数量表(reflux symptom index, RSI)，但敏感性及特异性均不够理想[6-7]。胃蛋白酶存在于胃食管反流发作期患者的唾液/痰中，并能在pH8.0以下保持稳定。由于气道中没有胃蛋白酶的产生，因此唾液胃蛋白酶测定在LPRD诊断中具有重要意义[8]。研究表明，痰/唾液中胃蛋白酶的检测可以被认为是诊断胃内容物近端反流或咽喉部反流的一种敏感的、非侵入性的方法[9-10]。胃蛋白酶是引起反流症状的主要原因，尤其是在弱酸性和非酸性反流中，唾液胃蛋白酶水平与反流参数和食管动力之间可呈现较好的相关性，提示胃蛋白酶试验可以作为判断反流程度的指标[11]。

目前GERD的诊断方法均存在一定的局限性。质子泵抑制剂(PPIs)诊断性治疗敏感性为71%，特异性为44%，其仅能提示酸反流与反流症状间的关系，且需要服用2周标准剂量的PPIs类药物，可能会造成不必要的长期PPI的使用。问卷调查是安全无创的诊断方法，但其主要依据主观感受，缺乏客观的检查结果，可能会导致漏诊漏治。胃镜检查及24hpH-MII属于侵入性操作，检查流程繁琐，在部分患者中不便于实施。而唾液胃蛋白酶检测可以快速识别GERD和非GERD疾病，对不同亚型GERD的临床诊疗也具有重要意义，胃蛋白酶检测相比24hpH-MII监测可以发现人群中更高比例的反流患者，可提高GERD诊断率，避免24hpH-MII获得的假阴性结果[12]。

2 唾液胃蛋白酶检测在GERD中的应用前景

典型症状和食管外症状的GERD组唾液中胃蛋白酶Ⅲ水平及检测阳性率较健康对照组均明显升高[13]。Kim等[14]通过检测临床疑似GERD的不典型症状患者痰/唾液中的胃蛋白酶水平，发现胃蛋白酶测定在大多数不典型症状组的敏感性和阴性预测值都很好，而其特异性和阳性预测值相对较低。Hayat等[12]在反流监测期间，对健康患者和GERD患者在清醒时、午餐后1h和晚餐后1h采集3份唾液样本。结果发现，在健康受试者和患者的唾液中都可以发现胃蛋白酶，与早晨的唾液样本相比，餐后唾液样本阳性可能性更大，且唾液胃蛋白酶水平更高。患者在午餐和晚餐后显示出最高的唾液胃蛋白酶水平，可以解释症状通常发生在餐后1～2 h[15]。但是Na等[16]确定唾液中胃蛋白酶存在的最佳时刻，显示最高值是在睡醒时, 可能与患者平卧睡觉体位有关。也有研究表明症状出现时的唾液样本对患者诊断价值更高[11]。因此，对于选取唾液标本收集时间点还需要进一步的研究。

最近研究表明，唾液胃蛋白酶是LPRD的重要指标，可以帮助诊断LPRD[15]。胃和食管黏膜具有针对胃蛋白酶的防御机制，比如黏液、蠕动以及分泌碳酸氢盐，但咽喉组织黏膜不具有上述特点，咽喉受到的刺激在胃内容物与黏膜直接接触后发生，这些胃内容物主要包括胃酸、胃蛋白酶和胆汁盐，胃内容物与LPRD发生密切相关[5]。在分泌性中耳炎患者的中耳液、泪水和唾液中检测到胃蛋白酶可以作为反流的直接证据，比使用喉镜和pH监测以及间接评估方法更有说服力，所以胃蛋白酶可以被认为是LPRD的可靠诊断标记物[8]。与24hpH-MII不同的是，胃蛋白酶测定是无创的，因为并不需要使用鼻导管等设备，只需要在唾液或痰等容易获取的样本上进行。研究证明除了胃部以外，咽喉、气管、肺、鼻窦、中耳等结构均有可能存在胃蛋白酶，提取不同组织的样本，比如痰、唾液、中耳渗液、鼻腔分泌物，就可以检测不同疾病与反流之间的关系[17]。唾液胃蛋白酶检测是诊断LPR的一种更简单、更经济、创伤更小的方法。通过较高的阈值和症状检测可以获得更大的诊断价值。如果唾液胃蛋白酶结果显示阴性后仍不能排除，24hpH-MII可以提供进一步的诊断依据[18-19]。逆转录PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)和蛋白质印迹法分析已经证实在咽喉部位LPRD患者或健康对照中均无法产生胃蛋白酶[20]。因此，咽喉中胃蛋白酶可以被看作LPRD的特异性标记物[21]。唾液胃蛋白酶检测可以作为一项补充试验，结合RSI和RFS问卷进行LPRD的诊断。有报道称胃蛋白酶检测可能最适合有近端反流和食道外症状的GERD患者[22]。然而，Dy等[23]发现单个时间点的唾液胃蛋白酶水平似乎与24hpH-MII、胃镜检查的LPRD儿童没有很好的相关性, 表明唾液胃蛋白酶不是诊断LPRD的足够灵敏的工具，需要更多的研究来确定重复的唾液采样是否会增加检测的敏感性，或者是否应该考虑诊断LPRD的不同参考标准。尽管我们认为其在临床上可能非常有用，但还需要更多的研究来将这项测试的结果与其他用于检测LPRD的方法进行比较，同时还需要评估治疗前后唾液胃蛋白酶的变化[12]。研究表明胃蛋白酶检测阳性对诊断LPRD具有特异性，而阴性不能排除LPRD[24]。因此，胃蛋白酶检测可以用于有GERD症状患者的筛查，在一定程度上补充传统检查方式的不足，从而提高患者的检出率，避免漏诊。未来还需要进行更深入全面的研究。

3 唾液胃蛋白酶检测在临床应用中存在的局限性

最近的荟萃分析表明，唾液胃蛋白酶测定的敏感性和特异性分别为64%和68%[5]，表明唾液胃蛋白酶诊断准确率并不是很高。正常人存在生理性反流，也可在唾液中检测出胃蛋白酶, 生理性反流可能降低唾液胃蛋白酶诊断GERD的特异度, 因此明确诊断阈值非常重要。反流到口腔的唾液胃蛋白酶, 经过唾液的稀释及食管的廓清, 浓度可下降, 故也有存在病理性反流但唾液胃蛋白酶浓度较低或未检出的问题, 而增加留取唾液的次数, 有助于增加敏感性。目前诊断阈值还没有统一的标准，而且也取决于检测唾液胃蛋白酶的方法。此外，患者是否可以在只有1个阳性样本的情况下诊断为GERD也存在质疑[25]。研究发现早晨唾液胃蛋白酶浓度对治疗反应有潜在的阴性预测价值，早上唾液胃蛋白酶浓度较高的患者上呼吸道黏膜的炎症反应较强，可能需要更长的时间才能痊愈[26]。然而，唾液胃蛋白酶浓度与GERD症状和疾病严重程度之间缺乏显著的关联否定了这一结论[27-29]。唾液胃蛋白酶浓度可能不能准确地衡量反流的严重程度，因为在24小时内观察到的波动范围很大，而且唾液样本必须在反流事件发生后不久采集且有严格的存放标准。另外，收集标本的时间是睡醒、餐后还是症状发作时对GERD价值更高国内外报道不一，没有统一的标准，确定最佳唾液收集方案可能有助于实现将唾液胃蛋白酶用作口咽反流的生物标志物的目标[22]。Kim等[14]进行的研究中，有典型反流症状的患者和没有典型反流症状的患者胃蛋白酶测试的阳性率差异无统计学意义。研究表明，唾液胃蛋白酶不能有效地区分健康的无症状对照组和确诊的胃食管反流患者[30]。根据已发现的证据，唾液中胃蛋白酶测定在区分不同GERD症状患者方面的敏感性(38%)和特异性(60%)较差[31]，似乎没有优势。唾液胃蛋白酶检测阳性与反流症状、生活质量评分和食管炎没有发现显著的相关性[23]。唾液胃蛋白酶测定对诊断GERD没有高度的特异性，而且唾液胃蛋白酶浓度高低不能区分GERD和功能性烧心(functional heartburn， FH)的患者，也不能区分诊断性PPI反应者和无反应者[32]。Fortunato等[33]发现，对于怀疑患有GERD的儿童来说，唾液胃蛋白酶检查将是一种理想的非侵入性诊断方法。但有研究发现，唾液胃蛋白酶测定对预测儿童病理性胃食管反流的敏感性较低[23]。其他作者也强调胃蛋白酶诊断儿童LPRD的敏感度和特异度较低[23]。唾液胃蛋白酶对于区分健康志愿者和伴有咽喉部反流症状的受试者没有明显作用，虽然伴有咽喉部反流症状组的唾液胃蛋白酶浓度较高，但该测试对于区分二者不具有良好敏感性或特异性[34]。所以，唾液胃蛋白酶对GERD的诊断方法、诊断标准、取样时间还需要进一步研究。其对区分不同症状GERD患者和衡量反流的严重程度没有发现明显的优势。

4 小结

综上所述，唾液胃蛋白酶检测是一种简便、无创、快速的方法，理论上可成为GERD的客观诊断依据。可以联合反流问卷或其他检查作为疑似GERD患者的筛查手段，提高GERD的检出率。但是，有研究显示，唾液胃蛋白酶浓度的高低与反流的严重程度之间缺乏显著的关联，对患者预后预测价值较差。唾液胃蛋白酶的检测方法、检测的最佳时机、位置及相应的临界值没有统一的标准。因此，未来应进行更大规模及规范的临床研究，对唾液胃蛋白酶测定在GERD筛查及诊断中的应用进行更加深入的探讨。