响应面优化竹叶黄酮酶法酯化及抗氧化评价

罗洪杰， 史波波， 王思懿， 祝佩瑶， 许 江， 钱俊青

(浙江工业大学药学院，杭州 310000)

竹叶黄酮是我国盛产的天然酚类化合物，具有多种生物活性，在抗菌、清除自由基、抗突变、清热解毒、调节血脂等方面均具有效果，抗氧化性较强[1-3]，是国家批准使用的食品抗氧化剂。目前，对竹叶黄酮的生理功能及抗氧化性能已开展了较为深入的研究[4]，黄酮含量较高的产品生理功能较强，特别是抗氧化性能有较大提升[5]。黄酮类化合物的自由基清除和抗氧化能力强弱取决于黄酮的类型和结构[6]。张英等[7]研究了12种黄酮单体清除自由基的能力，结果表明，12种黄酮均有清除自由基的能力，7种竹叶黄酮除含量较低的甲氧基牡荆苷外，其余6种清除和抑制活性氧自由基的能力超过或相当于槲皮素，表明竹叶黄酮的抗氧化活性超过银杏叶黄酮。

杨国栋等[8]通过邻苯三酚自氧化体系、邻二氮菲—Fe2+体系、自由基(DPPH)体系以及 H2O2诱导红细胞溶血体系对竹叶黄酮单体荭草苷和牡荆苷抗氧化活性进行研究，结果表明荭草苷能够清除超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH自由基，保护红细胞，一定浓度范围内呈良好的量效关系。牡荆苷也具有抗氧化活性，但清除自由基能力较荭草苷弱。Shibano等[9]采用DPPH清除自由基方法测试了12种黄酮单体的抗氧化能力，其中竹叶黄酮单体异荭草苷，荭草苷清除自由基的EC50为6.2～6.7 μg/mL，抗氧化能力较为突出。

竹叶黄酮抗氧化性能优异，作为食品抗氧化剂非常理想。但竹叶黄酮以糖苷的形式存在，多羟基及糖基结构，具较好的亲水性，油溶性较差[3]，因此，应用于油脂中进行抗氧化比较困难。我国是植物油消费大国，植物油所含的不饱和脂肪酸在储运中易氧化，严重影响油脂品质与食用安全性。目前商品植物油的抗氧化基本采用化学抗氧化剂，安全性不及天然抗氧化剂高，因此解决竹叶黄酮应用于植物油抗氧化的困难十分必要。同时竹叶黄酮产品的稳定性不够高，在储存中易氧化变质，也是需解决的重要问题。

植物黄酮可与脂肪酸或芳香酸在脂肪酶催化下直接发生酯化反应[10,11]。黄酮酯化后，不仅能提高其在油脂中的溶解性，也可增加储存稳定性[12]，作为植物油抗氧化剂应用十分有利。酶催化反应条件温和，可保持植物黄酮的分子结构不变，不影响其抗氧化等生物活性[13,14]，因此，开展酶催化竹叶黄酮酯化研究，可克服竹叶黄酮油溶性差的缺陷，有助于提高竹叶黄酮的储存稳定性。我国竹叶黄酮资源丰富，酶法酯化竹叶黄酮的研究开发具有理想的应用前景。

本实验以棕榈油为酰基供体，研究了竹叶黄酮与棕榈油的酶催化酯交换工艺。以曲面响应法优化酯化工艺条件，并采用石油醚和乙醇水溶液分别萃取回收未反应的棕榈油和竹叶黄酮，采用邻二氮菲Fe2+氧化法评价了竹叶黄酮酯的抗氧化活性，可为竹叶黄酮在油脂中的开发和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

竹叶黄酮(总黄酮质量分数43.0%)，Novozym®435脂肪酶，异荭草苷标准品，荭草苷标准品，牡荆苷，异牡荆苷，荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷，荭草素-2″-O-β-阿拉伯糖苷标准品(纯度98.0%)；维生素C、维生素E、棕榈油、叔戊醇等试剂均为分析纯；分子筛的有效孔径为0.4 nm。

Agilent 1200 series高效液相色谱仪，752型紫外可见光度计，ULUP-I-微量分析型超纯水机，R-201型旋转蒸发仪。

1.2 黄酮酶催化酯化方法

以竹叶黄酮(总黄酮质量分数43.0%)和棕榈油为反应底物，在50 mL锥形瓶中加入竹叶黄酮、棕榈油、脂肪酶，及经300 ℃活化6 h的0.4 nm分子筛，以干燥的叔戊醇为反应溶剂，在水浴中保温振荡反应，黄酮的酯化率作为指标，考察脂肪酶的种类、酶的用量、底物浓度比、酯化温度与时间、溶剂用量和分子筛的用量。通过单因素实验确定的酯化条件为：底物为0.45 g竹叶黄酮(43.0%)、2.0 g棕榈油、0.2 g Novozym 435脂肪酶，2 g 0.4 nm分子筛，反应溶剂叔戊醇15 mL，在60 ℃、210 r/min条件下振荡反应72 h，酯化率达30.0%。在此基础上，以响应面法优化酯化工艺。

1.3 黄酮酯的纯化方法

竹叶黄酮与棕榈油酯化反应完成后，回收未反应的黄酮及棕榈油，纯化竹叶黄酮酯。参考文献方法[15]，在酯化反应完成后将反应液真空旋转蒸馏，回收叔戊醇，固形物加入石油醚，萃取未反应的棕榈油，然后将萃取液离心分离，上清液真空旋蒸至干，称重，以石油醚萃取的棕榈油量计算除油率，通过液相色谱法检测计算竹叶黄酮酯的回收率，以除油率和回收率综合考察除油工艺。

将上一步离心得到的固形物采用95%乙醇溶解，离心去除沉淀，上清液真空蒸馏回收95%乙醇，固形物用乙醇水溶液萃取回收竹叶黄酮，萃取的油状物为竹叶黄酮酯。通过液相色谱法检测萃取纯化的竹叶黄酮酯纯度，并计算纯化的回收率，以黄酮酯的纯度和回收率考察萃取纯化工艺。

1.4 抗氧化实验方法

参考文献[16,17]，选择检测比较稳定的邻二氮菲Fe2+氧化法开展纯化的竹叶黄酮酯抗氧化性能评价。取0.2 mL 5×10-3mol/L邻二氮菲和1 mL 50×10-3mol/ L Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4)于5 mL具塞比色管中，加入0.2 mL 7.5×10-3mol/L FeSO4溶液，立即摇匀后，加入200 μL质量浓度相同的样品溶液，然后再加入0.2 mL l %的H2O2溶液，乙醇定容。充分摇匀后，37 ℃水浴中保温60 min，测定溶液在536 nm处的吸光度值。其清除率按公式计算：

清除率=[(A2-A3)/(A1-A3)]×100%

式中：A1为不加H2O2和样品时的吸光度；A2为加入H2O2和样品时的吸光度；A3为加入H2O2，但不加样品时的吸光度。

1.5 竹叶黄酮与黄酮酯液相色谱检测方法及黄酮酯色谱质谱联用检测方法

采用C18反相色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，柱温30 ℃，流动相：A(乙腈)和B(0.3%乙酸水)，梯度洗脱条件为0 min(10∶90)，25 min(100∶0)和35 min(10∶90)，进样量为20 μL，流速为0.7 mL/min，检测波长为330 nm[16]。以竹叶黄酮单体的标准品对照定性，混合黄酮酯的面积归一法进行纯度定量，混合黄酮酯总面积比较计算纯化工艺回收率。

黄酮酯HPLC色谱分离洗脱, 产物经阳离子源(ESI) 通过飞行时间质谱 (Agilent 6210 TOFMS，America)，电离模式采取阴离子模式，氮气流速4L/min, 30 psi 喷雾器压力，温度300 ℃，全扫描m/z50～1 500之间。

2 结果与讨论

2.1 竹叶黄酮原料及反应产物的检测

如图1所示，经6种竹叶黄酮组分单体的标准品色谱图比对，其中含量较高的组分2和组分3分别为异荭草苷和荭草苷，组分1为荭草素-2″-O-β-阿拉伯糖苷，保留时间20 min的组分为荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷。在保留时间30～33 min的含量较高的组分为牡荆苷及异牡荆苷，而保留时间45～55 min的峰是竹叶黄酮产品共存的其他竹叶成分，与文献[18]报道的竹叶黄酮组分一致。色谱检测表明，质量分数为43.0%的竹叶黄酮中6种组分齐全，对照文献[4,5]，各组分含量比例适宜，适合作为酶催化酯化研究的原料，可合理评价酯化得到的黄酮酯的抗氧化性能。

图1 竹叶黄酮的液相色谱图

酯化反应产物液相色谱检测结果如图2所示。保留时间为20～30 min的峰为竹叶黄酮酯混合产物。对其中含量最高的异荭草苷棕榈酸酯进行液相色谱与质谱联用检测，结果如图3所示。质谱图体现的分子质量符合异荭草苷棕榈酸酯的分子质量。图3表明，以棕榈油为酰基供体，脂肪酶催化竹叶黄酮可顺利进行酯化反应。

图2 竹叶黄酮和棕榈油的酶催化酯化产物色谱图

图3 异荭草苷棕榈酸酯的HPLC-MS分析图

2.2 黄酮酯化工艺响应面优化

2.2.1 单因素的方差分析

酯化工艺单因素确定后，通过F检验法对各单因素进行方差分析，评价其显著性。计算结果见表1，其中F>F临界值，P<0.001，则表示该因素对工艺有显著影响。除反应时间和溶剂用量外，其他因素均对黄酮酯化率有显著的影响。

表1 酯化工艺单因素的方差分析

2.2.2 PB实验设计及结果处理

在工艺单因素方差分析的基础上，考虑到酶的种类并不是本次实验的研究重点，故选显著性较强的其他4个因素作为PB设计的研究因素[19]，每个因素取两水平：高水平(+)和低水平(-)，以酯化率为考察指标。选取的各因素的水平如表2，M=4的PB实验设计和实验结果见表3。应用Design-Expert(8.01)软件对实验结果进行统计分析，计算结果见表4，P-value<0.01为显著的因素，从表4中可以看出，棕榈油的使用量为最显著的因素，温度和加酶量为较显著的因素，与文献报道的黄酮酶催化酯化影响因素相似[20,21]，因此以这3个因素作为响应面实验的单因素。

表2 PB实验设计各因素的水平

表3 PB实验(M=4)设计与结果

表4 ANOVA分析因素模型

2.2.3 响应面实验设计和结果分析

根据PB实验结果，以酯化率为响应值，筛选得到温度、酶添加量，棕榈油添加量3个因素，每个因素取两水平：高水平(+)和低水平(-)，实验设计及结果见表5。

表5 响应面分析实验及结果

经Design-Expert 8.0.6软件处理，采用一次型进行变异分析(Analysis of value，ANOVA)，其方差分析的结果见表6，对各因素与响应值进行回归拟合，得出模型对应的回归方程为：

酯化率=0.403 50A+44.050 00B+4.360 00C-10.547 21

表6 回归模型方差分析

由表6可以看出，以酯化率为响应值时，模型P=0.000 7<0.01，表明回归方差模型极显著，失拟项P值为0.880 7>0.05，不显著。所以该模型的拟合度较高，说明实验所得方程能较好地对响应值进行预测。此外该模型的决定系数R2=0.718 5，表明预测值与真实值有较高的相关性。根据文献[22]，相对较低的变异率(CV=3.2 %)说明实验的可操作性较好。因此，该模型可较好地分析和预测各因素变化时酯化率的真实情况。

若采用二次型进行变异分析，模型P=0.054 9>0.05，不显著，表明二次型不适用于本实验的变异分析。考察各因素之间交互作用的响应面及等高线图，结果表明温度与酶添加量(AB)、温度与棕榈油添加量(AC)、酶添加量与棕榈油添加量(BC)之间的交互作用均不明显，与方差分析结果相符。

根据回归模型，求得最佳的单因素条件为：A=60，B=0.25，C=2.0。即：反应温度60 ℃，脂肪酶的用量为0.25 g，棕榈油的用量为2.0 g，酯化率的预测值为33.39%。为了验证模型方程的有效性，进行了优化条件的验证实验，重复3次的平均酯化率为(33.13±2.0)%，实验值与预测值吻合情况较好。可见该模型可以用于竹叶黄酮的酶法酯化优化，证明该模型是合适的，有指导意义。与文献[23,24]报道的植物黄酮酶催化酯化工艺比较，具有较好的酯化效果。

2.3 竹叶黄酮酯的纯化

2.3.1 萃取棕榈油工艺石油醚用量考察

酯化反应结束后，以产物的质量和石油醚体积的比作为因素考查了萃取除油回收棕榈油工艺，实验结果如图4所示。随着石油醚体积的增大，除油率逐渐下降，但回收率则逐渐回升，当产物的质量和石油醚体积的比为12∶100时，除油率为95.5%，黄酮酯回收率为88.9%。2个指标均比较理想，故选取12∶100作为黄酮酯石油醚萃取除油的条件。

图4 石油醚的用量对除油率和黄酮酯回收率的影响

2.3.2 萃取竹叶黄酮的乙醇水溶液浓度确定

除油工艺确定后，考察了不同浓度的乙醇水溶液萃取回收残留竹叶黄酮的效果，除油的黄酮酯化产品质量70 mg，乙醇水溶液体积为10 mL，萃取实验结果如图5所示。随着乙醇浓度的增加，产品的纯度不断提高，但回收率则逐渐下降。当乙醇体积分数为30.0%时，黄酮酯的纯度达到84.4%，回收率达到82.1%。两个指标较理想，故以此乙醇水溶液浓度确定为萃取竹叶黄酮的条件。

图5 乙醇浓度对产品纯度和回收率的影响

根据实验结果，竹叶黄酮酯纯化方法确定为：酯化反应结束后，将产品真空旋干，回收叔戊醇，7.7 g产物加入石油醚100 mL，50 ℃温度下210 r/min振荡30 min，萃取未反应的棕榈油，以5 000 r/min离心分离，上清液为石油醚棕榈油层，固形物为竹叶黄酮与黄酮酯混合物，除油率为95.5%，黄酮酯回收率为88.9%。

将上一步得到的固形物用95%乙醇溶解，离心去除沉淀(包括酶和分子筛)，95%乙醇真空旋蒸回收后，按1 g固形物用30.0%的乙醇溶液150 mL的比例加入乙醇溶液，在50 ℃，210 r/min条件下振荡30 min后，分离上清液，而固形物即为黄酮酯。得到的竹叶黄酮酯经检测纯度达到84.4%，回收率为82.1%，纯化产品作为抗氧化评价样品。

2.4 竹叶黄酮酯抗氧化评价

对竹叶黄酮(AOB)，竹叶黄酮棕榈酸酯(AOB-PALM)与维生素C(VC)和维生素E(VE)进行抗氧化性能评价。以邻二氮菲Fe2+氧化法测定了四种抗氧化剂的自由基清除能力，半数清除率(IC50)表示抗氧化能力的强弱，结果如图6所示。竹叶黄酮酯产物比竹叶黄酮的自由基清除率有所下降，但仍具有较强的抗氧化活性，IC50介于维生素C和维生素E之间，与报道的竹叶黄酮抗氧化研究文献比较[25,26]，抗氧化评价结果类似，表明竹叶黄酮酯化产品的抗氧化性能保持良好。

图6 VC，VE，竹叶黄酮及黄酮棕榈酸酯的半数清除率IC50值

3 结论

以棕榈油为酰基供体，脂肪酶催化竹叶黄酮酯化，通过单因素考察和响应面优化，确定酯化的工艺条件为总黄酮质量分数为43.0%的竹叶黄酮0.45 g、棕榈油2.0 g，Novozym®435脂肪酶0.25 g，0.4 nm分子筛2 g，加入15 mL干燥的叔戊醇于50 mL锥形瓶中，在60 ℃，210 r/min条件下振荡反应时间72 h，酯化率达(33.1±2.0)%。

竹叶黄酮酯化反应完成后，分别采用石油醚和30.0 %的乙醇水溶液萃取回收未反应的棕榈油和竹叶黄酮，纯化得到的竹叶黄酮酯纯度达84.4%，回收率为82.1%。

酶催化棕榈油为酰基供体酯化竹叶黄酮，可有效提高竹叶黄酮的脂溶性，较好保留了竹叶黄酮的抗氧化活性，可作为食品抗氧化剂在植物油中应用。