响应面法优化姜黄油脂质体制备工艺及性能的研究

董雪容， 孟雨薇， 周 军,2， 李湘洲,2

(中南林业科技大学材料科学与工程学院1，长沙 410004) (中南林业科技大学 天然产物加工利用研究所2，长沙 410004)

姜黄，姜科的一种，来自于印度和南亚的原生植物，目前已经在世界范围内被发现，并被广泛地用作香料，赋予食物特有的风味和颜色，国际粮农组织和世界卫生组织都已承认其安全性[1]。在中国，姜黄作为一味中药已被使用1 000多年。姜黄硕大的根茎中含有的姜黄素和姜黄油等活性成分，使其具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗炎、平喘和镇痛等药理作用，最新研究表明，姜黄甚至可以通过抑制主要蛋白酶的表达而对COVID-2019病毒具有潜在抑制效果[2-4]。工业上姜黄主要用于提制姜黄素，而作为加工副产物的姜黄油因含有芳姜黄酮和α-姜黄烯等丰富的单萜、倍半萜和芳香族化合物，具有较强的抗氧化、抗炎和抗菌活性，已少量应用于食品、保健品等领域，但因其水溶性差、易挥发、生物利用度低、味辛辣且刺激等，姜黄油的深度开发与利用受限。

近年来，新型载体系统对改善挥发油的天然缺陷方面的研究与应用越来越多，如包合物[5]、纳米乳[6]、微胶囊[7]和脂质体等。脂质体是植物精油微胶囊化最有效的方法之一，对提高精油生物利用度、保护精油和实现精油缓释、控释[8]具有重要作用。脂质体也称为脂囊泡或囊泡，是由一个或几个脂质(通常是天然和合成磷脂)双层包裹组成的微观球形结构[9]。脂质体制备方法包括薄膜分散法[10]、有机溶剂注入法[11]、逆向蒸发法[12]、反复冻融法[13]等。薄膜分散法制备的脂质体为多层脂质体(MLV)，其包裹脂溶性药物的能力优越，几乎可以实现全部封装[14]。为了降低制备的脂质体粒径，常结合其他的分散方法，如超声、挤压等。 目前关于薄膜分散法超声波法制备姜黄油脂质体的研究鲜见报道。

本研究利用薄膜分散超声波法制备姜黄油脂质体，响应面法制备姜黄油脂质体的工艺，并对脂质体的结构特征、储藏稳定性、释放性能及抑菌活性进行表征，有利于姜黄油在食品、药品等领域的深度开发与利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干姜黄，市购。单核细胞增生李斯特菌(ATCC 19114)、大豆卵磷脂(纯度>70%)、胆固醇(纯度99%)。牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉，均为BR。

1.2 仪器与设备

ZS90马尔文纳米粒度仪，JEM-1400plus透射电子显微镜，PHSJ-4FpH酸度计，SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵，R-1001VN旋转蒸发仪，UV2310 Ⅱ紫外可见分光光度计，SHA-B水浴恒温振荡器，GH隔水式恒温培养箱。

1.3 方法

1.3.1 姜黄油的提取

采取水蒸气蒸馏法从姜黄中提取姜黄油。将干姜黄粉碎后称取70 g，置于1 L圆底烧瓶中，加入700 mL蒸馏水，连接精油提取器，加热至微沸，提取数小时后得到姜黄油，加入无水硫酸钠去除水分，得到黄色油状的纯姜黄油，4 ℃储藏，备用。

1.3.2 姜黄油脂质体的制备

采取薄膜分散超声波法[15]。称取一定比例的卵磷脂和胆固醇，加入一定量的精油于圆底烧瓶中，再加入10 mL无水乙醇，超声一定时间直至溶解，置于旋转蒸发仪(30 ℃，30 r/min)上蒸发分散，形成透明脂质薄膜。再加入10 mL PBS溶液(pH=7.2)恒温超声一定时间，静置精油脂质体，利用上述方法制备不加精油的空白脂质体。

1.3.3 姜黄油标准曲线绘制

配制姜黄油-无水乙醇溶液，以无水乙醇为参比，紫外分光光度计上200～600 nm范围进行扫描，测得姜黄油紫外最大吸收峰波长为236 nm。精密吸取50 μL姜黄油置于50 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇定容，得到1 μL/mL的浓溶液。配制成姜黄油体积分数分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 μL/mL的标准品溶液，分别在236 nm条件下测定不同浓度姜黄油标准溶液的吸光度值A，以标准溶液浓度C为横坐标、吸光值A为纵坐标绘制并获得标准曲线为A=38.462C+0.246 6，R2=0.998 5，此范围内线性关系良好。

1.3.4 姜黄油包封率的测定

采用有机溶剂萃取法测定姜黄油脂质体的包封率[16]。将姜黄油脂质体悬液倒入试管中，加入3 mL正己烷，充分混合后，静置1 h，收集的上层有机溶液，反复萃取3次后合并有机相，用无水乙醇定容至 25 mL，测定表层未包封的姜黄油量。姜黄油脂质体包封率的计算方法见式(1)。

EE=(V0-V1)/V0×100%

(1)

式中：EE为姜黄油脂质体包封率/%；V0为加入的姜黄油量/mL；V1为未包封的姜黄油量/mL。

1.3.5 单因素实验设计

分别考察姜黄油体积分数(姜黄油与无水乙醇的体积百分比)、大豆卵磷脂和胆固醇质量比、超声功率和超声时间对姜黄油包封率的影响。在大豆卵磷脂和胆固醇质量比5∶1，超声时间10 min，超声功率420 W的条件下，分别考察姜黄油体积分数为0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%对姜黄油脂质体包封率的影响。在体积分数1%，超声时间10 min，超声功率420 W的条件下，分别考察大豆卵磷脂和胆固醇比1∶0、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1对姜黄油脂质体包封率的影响。在体积分数1%，大豆卵磷脂和胆固醇比4∶1，超声功率420 W的条件下，分别考察超声时间10、20、30、40、50 min对姜黄油脂质体包封率的影响。在体积分数1%，大豆卵磷脂和胆固醇比4∶1，超声时间30 min的条件下，分别考察超声功率280、350、420、490、560 W对姜黄油脂质体包封率的影响。

1.3.6 响应面优化实验设计

在单因素实验的基础上，选取姜黄油体积分数(A)、大豆卵磷脂和胆固醇质量比(B)、超声时间(C)为考察因素，采用Box-Behnken设计对姜黄油脂质体的制备工艺进行优化。实验因素及编码见表1。

表1 实验因素水平及编码

1.3.7 形貌结构表征

将测试用铜网浸没于姜黄油脂质体中，2 min后取出铜网，去除表面多余的脂质体，自然风干，用2%的磷钨酸染色5 min，去除多余的染液，自然风干后进行透射电镜分析。

1.3.8 PDI和粒径分析

将样品经适当稀释后，采用马尔文纳米粒度仪测定其PDI和粒径，每个样品平行测定3次。

1.3.9 储存稳定性分析

取2组姜黄油脂质体，分别置于4 ℃的恒温冰箱和25 ℃的恒温培养箱中，并于第1、2、3、4、5、6、7、14 d时取样，利用pH计测定待测样的pH值。

1.3.10 释放性能研究

根据欧盟委员会法规10/2011 EU (10/2011/EC)[17]，选取食品模拟介质10%乙醇，50%乙醇作为释放介质，研究姜黄油脂质体的释放性能。移取等量脂质体悬液于透析袋(14 ku)中，分别置于10%乙醇和50%乙醇中37 ℃恒温振荡，分别于第1、2、3、4、5、6、8、10、12 h移取3 mL释放液，并补充等量新鲜释放介质。释放液于236 nm下测定吸光度，计算姜黄油累积释放量。分别用零级释放动力学方程、一级释放动力学方程、Higuchi 方程、Ritger-peppas对体外释放结果进行释放动力学拟合。

1.3.11 姜黄油脂质体对单增李斯特菌的抑菌性能研究

利用平板菌落计数法测定姜黄油脂质体的抑菌性能。将单增李斯特菌活化，添加3 mL姜黄油脂质体至单增李斯特菌PBS(pH=7.2)菌悬液中，体积分数30%，37 ℃恒温振荡培养，分别于第0、1、2、3、4天进行平板涂布计数，观察单增李斯特菌菌落变化情况。

1.3.12 数据统计与分析

采用IBM SPSS Statistics22软件做单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05，具有显著性差异；Origin 2018进行相关图表的绘制。

2 结果与分析

2.1 不同因素对制备的姜黄油脂质体中姜黄油包封率的影响

分别研究了姜黄油体积分数、大豆卵磷脂和胆固醇质量比、超声时间和超声功率对制备的姜黄油脂质体中姜黄油包封率的影响，实验结果和图1所示。

图1 各因素对包封率的影响

由图1可知，随着姜黄油体积分数的增大，包封率呈现先上升后下降的趋势。当姜黄油体积分数为1%时，包封率达到最大值为83.65%。姜黄油过量会超过脂质膜的包封能力，导致包封率下降，故宜选择姜黄油体积分数为1%。随着卵磷脂和胆固醇配方中卵磷脂比例的增加，包封率呈现先增大后减小的趋势，在4∶1时包封率达到最大值为85.2%。大豆卵磷脂是脂质体的主要成分，胆固醇具有调节膜流动性和稳定性的功能。当大豆卵磷脂量少时脂质体膜不易形成，而当胆固醇含量低时膜易流动且不稳定，导致精油泄漏[18]。因此，宜选择大豆卵磷脂和胆固醇质量比为4∶1。随着超声时间的增加，包封率呈先上升后下降的趋势，当超声时间为30 min时，包封率达到最大值为92.35%。超声时间过长会引发脂质体结构变化，导致精油泄漏，而时间过短时，脂质体粒径分布不均匀，体系不稳定[19]。因此，宜选择超声时间为30 min。随着超声功率的增大，包封率呈先上升后急剧下降的趋势，当超声功率为420 W时，包封率达到最大值为92.35%，当功率超过420 W时，包封率下降，主要是超声过度导致姜黄油脂质体膜双分子结构的破坏[20]。

2.2 响应面优化分析

测定不同处理条件下的姜黄油包封率，结果见表2。利用Design Expert 10 实验设计软件对指标Y与影响因素间的关系进行多元回归分析，结果见表3。

表2 Box-Behnken设计表及效应值

表3 响应面回归分析结果

由表3可知，预测模型的P值小于0.05，说明模型显著；失拟项的P值大于0.05，说明模型对真实情况的模拟是准确的，表明该预测模型可以用于姜黄油脂质体制备工艺的优化。拟合得到的多元二次方程式为：

Y=90.52+2.31A-1.46B-1.88C+6.55AB-1.87AC-1.83BC-0.14A2-1.19B2-1.01C2

最佳制备工艺条件为姜黄油体积分数1.2%，卵磷脂和胆固醇4.8∶1，超声时间20.9 min，此条件下预测的最大响应值为100%。根据实验实际情况，选取姜黄油体积分数1.2%，卵磷脂和胆固醇质量比5∶1，超声时间21 min进行验证实验，重复3次，测得制备的姜黄油脂质体中姜黄油包封率为96%，与理论值接近，表明响应面模型对姜黄油脂质体的制备具有现实指导意义。

2.3 姜黄油脂质体形态结构分析

姜黄油脂质体的透射电镜分析结果见图2。姜黄油脂质体呈均匀半透明的乳白色液体。透射电镜下观察可以看到姜黄油脂质体具有磷脂双分子层结构。图3粒径分析结果表明，空白脂质体的平均粒径为230 nm，而姜黄油脂质体的平均粒径为896 nm。姜黄油脂质体的粒径大于空白脂质体，原因可能是精油插入脂质双分子层中，从而降低磷脂分子间的

图2 姜黄油脂质体及其透射电镜分析

聚合性，引起粒径的增大[21]。Bai等[22]报道薏仁油的装载能力明显会增大脂质体的粒径。Lin等[23]报道粒径大小随着菊花精油浓度的增大而增大。多分散性系数PDI分析结果表明，空白脂质体的PDI为0.47，姜黄油脂质体的PDI为0.44。精油脂质体的多分散性小于空白脂质体，说明其均匀性有所提高[24-26]。

图3 空白脂质体和精油脂质体的粒径和PDI

2.4 姜黄油脂质体储存稳定性分析

脂质体稳定性是评价脂质体质量的重要指标之一。在脂质体体系中，卵磷脂为脂质体双层膜主要成分，易被水解氧化成游离的脂肪酸和溶血磷脂酰胆碱[27]。通过测定不同储藏条件下的pH，可以有效反映脂质体的稳定性，结果见图4。姜黄油脂质体分别在4 ℃和25 ℃的条件下储存14 d，pH均接近中性，无显著变化，说明姜黄油脂质体在此条件下相对稳定，未分解产生过多的游离脂肪酸，短时间内在4 ℃和25 ℃下均可以储存姜黄油脂质体。

图4 不同储存条件下姜黄油脂质体pH的变化

2.5 姜黄油脂质体释放性能分析

姜黄油脂质体分别在10%乙醇和50%乙醇模拟释放液中的释放效果见图5。在10%乙醇介质中，姜黄油脂质体中的姜黄油释放缓慢，12 h内的累计释放率仅为11.7%，而在50%乙醇介质中，姜黄油的释放相对较快，12 h内的累计释放率为21.5%(P<0.001)。对不同介质中的释放效果分别进行零级释放动力学、一级释放动力学方程、Higuchi方程和Ritger-peppas方程拟合，结果见表4。在10%乙醇中，脂质体中姜黄油的释放机制符合Ritger-peppas方程，n=0.196 4，说明释放过程以扩散机理为主[28](n<0.5是扩散机理，0.450.89是溶蚀机制)。姜黄油脂质体在50%乙醇介质中的释放符合一级释放动力学方程，表现为缓释制剂的基本释放特征。

图5 姜黄油脂质体分别在10%乙醇和50%乙醇模拟释放液中的释放效果

2.6 姜黄油脂质体抑菌性能分析

前期研究表明，姜黄油对食源性致病菌单增李斯特菌的抑制效果较好，因此选取单增李斯特菌研究姜黄油脂质体的抑菌性能，结果见图6。单核增生李斯特菌菌悬液的初始菌数为7.5×107，在菌悬液中加入3 mL姜黄油脂质体培养1 d后菌落数显著降低(P<0.001)，且随时间的增加，菌落数呈继续下降的趋势，说明姜黄油脂质体能缓慢释放姜黄油，并对单增李斯特菌表现出长效抑菌的效果。

表4 不同释放介质下的释放动力学模型拟合结果

注：标有不同字母表示数据有显著差异(P<0.05)。图6 姜黄油脂质体对单增李斯特菌的抑菌性能

3 结论

利用响应面优化获得了姜黄油脂质体的制备工艺为姜黄油体积分数1.2%，卵磷脂和胆固醇5∶1，超声时间21 min，此条件下制备的脂质体中姜黄油的包封率为96%，建立的响应面模型可靠，对姜黄油脂质体的制备具有指导意义。姜黄油脂质体具有磷脂双分子层结构，粒径为896 nm，属于大单室脂质体(LUV)，PDI 多分散指数为0.44。分别在4 ℃和25 ℃的条件下储存14 d，姜黄油脂质体的稳定性良好。10%乙醇和50%乙醇的释放介质中姜黄油脂质体均具有一定的缓释效果，且分别符合Ritger-peppas和一级释放动力学模型。姜黄油脂质体对单增李斯特菌具有长效的抑菌效果。

脂质体技术可以有效提高姜黄油的稳定性，使姜黄油缓慢释放而达到长效抑菌的效果，拓展了姜黄油等植物精油在食品保鲜等领域的开发与应用。