不同品种葡萄籽油脂肪酸含量的测定

陈晓祥， 杨 璐， 于思琳， 郭雪丽， 张 珂

(石河子大学药学院1，石河子 832002) (新疆林果树种选育与栽培重点实验室2，乌鲁木齐 830052) (新疆林木资源与利用国家林业和草原局重点实验室3，乌鲁木齐 830052) (哈尔滨医科大学药学院4，哈尔滨 150000)

葡萄籽是葡萄科葡萄属葡萄(Vitisvinifera)果实的种子。新疆吐鲁番属于国家优质葡萄主要生产基地，拥有极丰富的葡萄品种。所产葡萄通常多数用于酿酒[1]，而在此过程中会产生大量以葡萄籽为主的皮渣废弃物[2]，这说明我国具有丰富的的葡萄籽资源。

葡萄籽油以葡萄籽提炼制成，富含90%左右的不饱和脂肪酸[3]，以亚油酸和油酸为主，可促进胆固醇代谢，使人体血液黏稠度降低，改善血液微循环，起到防止血栓形成、防治动脉硬化和心肌梗塞的作用[4]。同时葡萄籽油还是少量具有良好活性的亲脂性化合物的天然宝贵来源，如生育酚、生育三烯酚和甾醇等[5,6]。目前葡萄籽油已作为部分降压药的有效成分应用于医药领域[4]，还可与其他油脂复配，提高食用油的抗氧化力并延长保质期[7]。但葡萄籽油中这些活性物质的含量及活性随着提油技术、葡萄品种、种植条件等因素的不同而存在一定的差异[8，9]。

目前我国对葡萄籽油的研究多集中于部分品种，如赤霞珠、霞多丽、红提等[8，10,11]，提取方式多采用索式提取法，且只对含量较高的几种脂肪酸进行相对定量[12,13]。此种方法耗时长，样品用量大，脂肪酸的组成及含量的检测有限[14,15]。因此，为进一步开发葡萄籽，提高对不同品种葡萄籽的利用效率，本研究采集了40个作为新疆吐鲁番地区主栽品种的葡萄，建立了超声波辅助提取法提取油脂，气相色谱-质谱联用仪为基础进行定性和定量的方法，对这些葡萄籽进行油脂提取和脂肪酸成分及含量分析，以选择出更适宜进行葡萄籽油提取的葡萄品种，促进葡萄籽在食品、化妆品和制药行业中作为二次原料再利用[16]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 原料及试剂

40个品种葡萄鲜样，采于新疆吐鲁番，分离出新鲜葡萄籽后，于-20 ℃冰箱中保存备用。十九烷酸乙酯、37种脂肪酸甲酯混标、异辛烷(色谱纯)、正庚烷(色谱纯)、石油醚(60～90 ℃)、正己烷、乙酸乙酯、氢氧化钾、硫酸氢钠、甲醇均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

7890A/5975C GC-MS联用仪，Syncore Plus平行浓缩仪，MM400混合球磨仪。

1.2 方法

1.2.1 标准及内标溶液的配制

内标液的制备：准确称取50 mg十九烷酸乙酯，取正庚烷溶解并定容至10 mL，配制成5 mg/mL的标准品溶液。

脂肪酸甲酯混标储备液制备：取25 mg脂肪酸甲酯混标，正庚烷溶解并定容至5 mL，配制成5 mg/mL的混标溶液。

1.2.2 样品前处理

取适量新鲜的葡萄籽，经液氮冷冻后研磨成粉末，精密称取1 g粉末于离心管中，加入20 mL石油醚，密封，超声30 min后离心，取上清液于平行浓缩仪中真空浓缩，再105 ℃烘1 h以除杂，所得葡萄籽油留存备用。

1.2.3 样品的甲酯化

准确量取葡萄籽油15 mg(精确到0.1 mg)，加2 mL异辛烷溶解油脂，试样溶解后加入2 mol/L的氢氧化钾甲醇溶液200 μL进行甲酯化，盖上盖子猛烈振摇30 s后静置5 min，加入5 mg/mL内标溶液50 μL，混匀，再加入约1 g硫酸氢钠，猛烈振摇，中和氢氧化钾，待盐沉淀后取上清液稀释至合适浓度，经0.22 μm微孔滤膜过滤待测。

1.2.4 仪器条件

色谱柱为HP-88 毛细管柱(100 m×0.2 mm×0.25 μm)；进样口温度250 ℃；柱箱升温程序初始温度为75 ℃，10 ℃/min升至165 ℃，保持1.5 min，再1.5 ℃/min升至185 ℃，保持5 min, 再1.5 ℃/min升至195 ℃，保持5 min再3.2 ℃/min升至240 ℃，保持8 min。离子源为EI源，温度230 ℃。载气为He，流速为1.0 mL/min；进样方式为分流模式，分流比10∶1；进样量为0.5 μL。定性分析为全扫描模式(SCAN)，扫描范围为50～500m/z，定量分析为选择离子模式(SIM)，以丰度最高的碎片离子作为定量离子。

1.2.5 数据统计分析

本方法对标准溶液采用保留时间与特征选择离子双重定性，所得数据通过质谱标准库NIST库进行鉴定。脂肪酸含量通过内标标准曲线法进行定量。SPSS 26.0对数据进行T检验，SIMCA 14.0软件进行聚类分析。

注：1∶C12∶0；2∶C14∶0；3∶C15∶0；4∶C16∶0；5∶C16∶1；6∶C17∶0；7∶C18∶0；8∶C18∶1n9c；9∶C18∶2n6t；10∶C19∶0(内标)；11∶C18∶2n6c；12∶C20∶0；13∶C18∶3n3；14∶C20∶1；15∶C21∶0；16∶C20∶2；17∶C22∶0；18∶C20∶3n6；19∶C23∶0；20∶C24∶0。图1 样品中脂肪酸甲酯色谱图

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定

在该色谱条件下，内标物十九烷酸乙酯及37种脂肪酸甲酯混合标准品显示出较好的分离效果，基本达到基线分离。图1是样品的总离子流色谱图，除内标外，可检测出19种脂肪酸，葡萄籽油中含量较高的脂肪酸主要是棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1n9c)和亚油酸(C18∶2n6c)4种，集中在20～40 min被分离。

2.2 提取方法的确定与优化

2.2.1 提取方式考察

精密称取5.0 g葡萄籽粉末于索氏抽提器中，注入200 mL石油醚，保持微沸状态回流提取8 h。提取所得液体于40 ℃下减压浓缩并105 ℃烘1 h。所得葡萄籽油进行衍生并上机测试。

该方法下所得油样可测得21种脂肪酸，总含量为59.20 g/100 g油。超声波辅助提取法所得油样可测得19种脂肪酸，总含量为73.62 g/100 g油。与前者相比，超声波辅助提取法所得油样无法检测到六烷酸(C6∶0)及八烷酸(C8∶0)，但二者总含量仅为0.06 g/100 g油。综合考虑，超声波辅助提取法可测得的脂肪酸总含量更高，且方便高效，更适宜于批量样品的检测，因而可以选用超声波辅助提取法进行后续实验。

2.2.2 前处理条件优化

精密称取1 g葡萄籽粉于离心管中，加入石油醚，超声提取一定时间后离心，取上清液真空浓缩并高温除杂。固定其他因素，分别考察不同提取溶剂(石油醚、乙酸乙酯、正己烷)，料液比(m/V为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)，提取时间(15、30、45、60 min)对37种脂肪酸提取影响。

3种提取溶剂所得油样均可检测到19种脂肪酸，其中饱和脂肪酸有11种，单不饱和脂肪酸3种，多不饱和脂肪酸5种。肪酸总含量的结果在不同提取溶剂中分别为，乙酸乙酯(79.53 g/100 g油)>石油醚(73.62 g/100 g油)>正己烷(73.34 g/100 g油)，乙酸乙酯所得油样较浑浊，易造成定量不准确，综合考虑选择石油醚作为提取剂。4种料液比下所得油样均可检测到19种脂肪酸，料液比1∶20时测得总含量最高，为71.05 g/100 g。4种提取时间下所得油样均可检测到19种脂肪酸，超声时间为30 min时测得总含量最高，为71.28 g/100 g。因此，确定石油醚作为提取剂，料液比1∶20，超声时间30 min为葡萄籽油最优提取条件。

2.3 方法学考察

将原混合标准溶液分别稀释成不同浓度水平的标样上机检测，各脂肪酸甲酯与内标峰面积比值为y，各脂肪酸甲酯与内标浓度比为x，进行线性回归。结果中，内标物及37种脂肪酸甲酯在60 min内均被良好分离，各回归方程的决定系数R2为0.999 0～0.999 8，线性范围为0.02～23.67 μg/mL。

取合适浓度脂肪酸甲酯混标溶液连续检测6次以考察仪器精密度，各组分含量的相对标准偏差值(RSD)在3.1%～3.9%之间。另检测6份平行处理得到的样品以考察实验方法的重复性，测得结果RSD值在0.12%～4.34%之间。取其中1份样品，分别于0、6、12、24、36、48、72 h时检测，72 h时检测与第1次检测结果的RSD值小于5.0%，说明该样品在72 h内可保持稳定。向样品中添加一定量标准品以考察方法的加标回收率，设置6个平行，计算得各组分平均回收率在74.09%～107.52%之间，RSD值在1.12%～5.28%之间。该方法可行。

2.4 不同品种葡萄籽油中脂肪酸组成及含量的测定

从40个品种葡萄籽油的脂肪酸成分及含量测定结果中可以看出，脂肪酸总含量在65.98～99.75 g/100 g之间，亚油酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸为葡萄籽油脂肪酸的主要成分。多不饱和脂肪酸(PUFA)占总脂肪酸的66.59%～83.09%，单不饱和脂肪酸(MUFA)为11.24%～25.09%，饱和脂肪酸(SFA)为5.23%～9.32%。所测葡萄籽油中脂肪酸含量关系均为多不饱和脂肪酸最高，饱和脂肪酸含量最少，这与之前的相关报道一致[17,18]。这些葡萄籽油中有14个品种的脂肪酸总含量在90 g/100 g以上，同时，这些品种的不饱和脂肪酸总含量均在87.50 g/100 g以上。40个品种中赤林的总脂肪酸含量和不饱和脂肪酸含量均最低，总脂肪酸含量为65.98 g/100 g，不饱和脂肪酸含量为60.25 g/100 g。沈农金皇后总脂肪酸含量最高，是赤林的1.51倍，为99.75 g/100 g。巨玫瑰的不饱和脂肪酸含量最高，为93.10 g/100 g，是赤林的1.55倍。作为人体必需脂肪酸亚油酸，在灰比诺品种葡萄籽油中含量最高，其次是赤霞珠。灰比诺品种葡萄籽油中亚油酸为79.45 g/100 g，是赤林的1.69倍，占总脂肪酸含量的81.42%。其多不饱和脂肪酸含量为79.73 g/100 g，在40个品种中含量也是最高的。这些品种的葡萄籽适宜作为良好的油源进行后续的加工利用，其中灰比诺可作为生产富含亚油酸葡萄籽油的优质品种。

葡萄籽油中可检测到的主要的反式脂肪酸(TFA)为反油酸(C18∶2n6t)，植物油氢化是TFA的主要来源[19]。TFA摄入过多易诱导血脂异常，促进氧化应激，从而增加心血管疾病发生的危险[20,21]。40种葡萄籽油反油酸的含量为总脂肪酸含量的0.03%～0.14%，普遍低于市面常见的食用植物油[22]。

油中脂肪酸总含量较低的葡萄籽品种有赤林、蛇龙珠、大巨峰、晚红蜜、红达拉伊利，总含量均在70 g/100 g以下。这些品种的葡萄籽油中推测含有较高浓度的亲脂性化合物，如生育酚和植物甾醇等[5,6]，这类化合物同样具有一定生物活性。在制药、食品和化妆品工业中，这类品种的葡萄籽可以应用于富含此类化合物产品的开发利用。从而更好地提高各品种葡萄籽的应用价值。

2.5 脂肪酸聚类分析

为了进一步通过脂肪酸含量分析不同品种葡萄籽油之间的差异，使用SIMCA 14.1软件对40个品种葡萄籽油进行聚类分析。如图2所示，树状图中有2个明显的主要分支，即40个品种的葡萄籽油可被明显分为两类，各分支下的品种脂肪酸成分组成相似，距离越近，则相似度越大。在实际生产过程中，以脂肪酸构成相似的葡萄籽品种作为油源，有助于产品的一致性，而组成相差较大的品种则相反。根据树状图结果将各葡萄籽油样品分为两组，即组1和组2，以饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸和反式脂肪酸含量为指标，对两组样品间成分进行T检验，结果显示两组样品的四类成分之间均有显著差异(P<0.05)。

图2 不同品种葡萄籽油的聚类分析图

进一步对组1和组2进行有监督的正交偏最小二乘判别分析，结果见图3。OPLS-DA模型中R2X、R2Y和Q2分别为0.942、0.822和0.806，表明此模型拟合较好。结合S-plot图和VIP>1的化合物可知，亚油酸和油酸对于品种间的分类具有较大贡献率，可作为区分不同品种间葡萄籽油的差异性成分，为后续区分品种质量提供初步参考依据。

图3 不同品种葡萄籽油的OPLS-DA图(a)和S-plot图(b)

3 结论

本研究建立了GC-MS定性定量分析葡萄籽油中37种脂肪酸标准样品中脂肪酸成分的检测方法，相比于传统的索式提取法，该方法前处理简单，准确可靠，更适用于对批量样品中脂肪酸含量的测定。本实验确定了灰比诺、赤霞珠、沈农金皇后、巨玫瑰等品种可作为富含脂肪酸的葡萄籽油提取的优势品种，其中灰比诺品种葡萄籽油中亚油酸含量最高，赤霞珠其次。亚油酸和油酸对不同品种葡萄籽油的分类具有较大贡献作用，可为后续品种的比较研究及利用提供一定参考。