高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱联用技术测定高脂作物中的硒形态

王铁良， 周晓华， 刘进玺， 魏 红， 张 迪， 郭 洁， 贾 斌， 李慧展， 杨军勇

(河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所1，郑州 450002) (农业部农产品质量安全风险评估实验室(郑州)2，郑州 450002) (河南省粮食质量安全与检测重点实验室3，郑州 450002) (河南省科学器材供应中心4，郑州 450002)

硒是人体必需的微量元素，具有清除体内自由基、高抗氧化作用，可以有效地抵御病变，增强免疫力，适当补硒对一些由硒匮乏引起的疾病有一定的改善作用[1-6]。人们常通过硒营养强化剂、硒片、富硒食物等补硒，其中富硒食物因为便捷而得到了广泛的应用，因此，富硒大米[7，8]、富硒小麦[9]、富硒香菇[10，11]、富硒灵芝[12]、富硒大豆[13]、富硒猪肉[14]、富硒鸡蛋[15]、富硒大豆[16]、富硒甘薯[17]、富硒瓜菜[18]等富硒食品的生产及研究日益成为焦点，不断地受到人们的推崇。

目前，绝大多数食品标签、证书及一些食品标准中所涉及到的硒含量均为总硒含量，而食品中的硒包括了无机硒和有机硒，长期食用含无机硒的食物，可能会引发一些疾病[19]；而小分子的有机硒，诸如硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸等则更有益于人体吸收。因此，面对市场上参差不齐的富硒产品，需要对其进行硒元素形态分析来了解并对富硒食品进行一定的规范。

我国是世界上生产芝麻最多的国家之一。芝麻是一种含油率很高的优质油料作物，我国芝麻分布广泛，食用率高；花生是一种营养价值高，利用途径多且富硒能力较强的作物，是中国重要的油料作物和经济作物，食用范围比较广；核桃营养价值丰富，有“万岁子”“长寿果”“养生之宝”的美誉，核桃中86%的脂肪是不饱和脂肪酸，有很大的食用价值。因此，诸如此类高脂作物，营养美味，更适宜人们补硒。本文主要是优化建立一种富硒高脂作物中硒形态的提取方法，了解市场上芝麻、花生、核桃等富硒高脂作物中存在的硒形态。李娟等[20]、张卓等[21]主要研究的花生中的赋存形态为蛋白态、多糖态及脂肪态，鲜有涉及硒代氨基酸等小分子形态。因此，本文可为高脂类作物的硒形态提取提供依据，并为市场上此类富硒食品的规范提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

硒代半胱氨酸(99%纯度)；磷酸氢二铵、硼氢化钾、氢氧化钾，碘化钾、四丁基溴化铵(优级纯)；链酶蛋白酶；脂肪酶；三(羟甲基)氨基甲烷Tris(分析纯)；亚硒酸根、硒酸根、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸标准溶液；甲醇、乙腈(色谱纯)；盐酸、硝酸(优级纯)；实验用水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

SA-50液相色谱-原子荧光光谱联用仪，Milli-Q Syhthesis超纯水系统，超声仪，离心机。

1.3 实验方法

1.3.1 仪器条件

液相色谱条件：色谱柱：Agela MP-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：30 mmol/L (NH4)2HPO4+0.5 mmol/L四丁基溴化铵+2%甲醇(甲酸调节pH=6.0)；流速：1.0 mL/min；进样量：100 μL。

氢化物发生参数：载流：10% HCl；还原剂：0.35% KOH+2% KBH4+0.1% KI；紫外消解。

原子荧光参数：元素灯：硒空心阴极灯；负高压：300 V；灯电流：90/45 mA；载气：300 mL/min；屏蔽气：600 mL/min。

1.3.2 标准溶液配制

分别取亚硒酸根[Se(IV)]、硒酸根[Se(VI)]、硒代半胱氨酸(Secys)、甲基硒代半胱氨酸(SeMecys)、硒代蛋氨酸(Se-Met)等配制成浓度为1.00 mg/L的混合标准溶液中间液，再用中间液配制标准曲线。

1.3.3 样品前处理

将富硒花生、核桃、芝麻试样粉碎均匀，取适量样品按照NY/T 1285—2007对样品进行脱脂处理。

将富硒花生、核桃、芝麻试样粉碎均匀，取适量样品按照GB 5009.93—2017对样品进行总硒测定。

称取脱脂后的样品0.1 g放入离心管中，加入6 mL 130 mmol/L的TRIS-HCl缓冲液(pH=7.5),振荡混匀，加入15 mg链酶蛋白酶后混匀，37 ℃超声振荡30 min，10 000 r/min高速离心机离心10 min，上清液过0.22 μm有机滤膜后上机。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

本研究比较了用Hamilton PRP-X100(250 mm×4.1 mm,10 μm)阴离子交换柱和Agela MP-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)反相C18柱来进行分析比对。实验中采用Hamilton PRP-X100阴离子交换柱，使用柠檬酸流动相时不能完全基线分离[22]；使用磷酸氢二胺流动相时，无论等度还是梯度，分离时间均未低于15 min，且未完全基线分离，分离色谱图如图1所示。采用C18柱时，等度洗脱条件下可以在10 min内实现5种硒形态的完全基线分离，分离效果明显强于使用Hamilton PRP-X100阴离子交换柱。因此采用反相C18柱来进实验分离，分离色谱图如图2所示。

注：1 硒代半胱氨酸；2 硒甲基硒代半胱氨酸；3 亚硒酸根；4 硒代蛋氨酸；5 硒酸根，浓度均为80 μg/L。图1 5种硒形态标准溶液在梯度a、等度b条件下的色谱图

注：1 硒代半胱氨酸；2 硒甲基硒代半胱氨酸；3 亚硒酸根；4 硒代蛋氨酸；5 硒酸根。质量浓度均为80 μg/L。图2 5种硒形态标准溶液色谱图质量

2.2 高脂作物样品中硒形态提取方法的优化

2.2.1 样品形态及酶种类的选择

本研究以富硒花生Sample1(总硒测定结果为1.24 mg/kg)为实验样品。称取该富硒花生鲜样6份，每份0.2 g，双平行，加入6 mL 130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)，振荡混匀，再分别加入15 mg链酶蛋白酶+15 mg脂肪酶、15 mg脂肪酶、15 mg链酶蛋白酶，分别命名为X-1，X-2，X-3；再称取该富硒花生脱脂后样品6份，每份0.1 g，双平行，加入6 mL 130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)，振荡混匀，再分别加入15 mg链酶蛋白酶+15 mg脂肪酶、15 mg脂肪酶、15 mg链酶蛋白酶，分别命名为T-1、T-2、T-3。6组样品于37 ℃下超声振荡提取30 min，然后用10 000 r/min高速离心机离心10 min，鲜样上清液先过C18小柱，再过0.22 μm有机滤膜后上机，脱脂样直接过0.22 μm有机滤膜后上机。

结果发现只加了脂肪酶的X-2与T-2均未出峰，而其余4组出峰均为硒代蛋氨酸，且X-1与X-3峰面积基本一致，T-1与T-3峰面积基本一致，同时T-3峰面积比X-3峰面积略大。选择使用脱脂后的样品进行实验，无需过C18小柱，无需加脂肪酶，方便简洁。

2.2.2 提取剂种类的选择

称取脱脂后样品0.1 g，分别加入6 mL 10% HCL、10% HNO3、130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)、0.1 mol/L KOH、超纯水、20%甲醇/水、20% 乙腈/水，分别加入链酶蛋白酶15 mg和均不加入任何酶，各一式两份，14组样品于37 ℃下超声振荡提取30 min，然后用10 000 r/min高速离心机离心10 min，过0.22 μm有机滤膜后上机。

实验发现，加链酶蛋白酶的样品在同等条件下提取到的硒代蛋氨酸均略高于不加酶的，另外发现加10%HCl、10% HNO3、0.1 mol/L KOH、20%甲醇/水、20% 乙腈/水这5组的都只能提取到少量的硒代蛋氨酸，而加130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)和超纯水均能提取到很高的硒代蛋氨酸，且加130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)提取剂的提取效率最高，因此采用130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)作为提取剂。

2.2.3 优化Tris-HCL缓冲液的浓度

配制Tris-HCL浓度分别为10、30、50、70、90、110、130、150、170、190 mmol/L ，调节pH=7.5。

称取脱脂后样品0.1 g，分别加入6 mL不同浓度Tris-HCL缓冲液，振荡混匀，再分别加入15 mg链酶蛋白酶，10组样品于37 ℃下超声振荡提取30 min，然后用10 000 r/min高速离心机离心10 min，过0.22 μm有机滤膜后上机，结果如图3所示，在Tris-HCL缓冲液浓度达到130 mmol/L时，硒代蛋氨酸含量达到峰值，随着浓度继续增加，硒代蛋氨酸的含量并未增加，因此，选择130 mmol/L Tris-HCL缓冲液作为提取剂。

图3 不同Tris-HCL浓度下硒代蛋氨酸的含量

2.2.4 优化Tris-HCL缓冲液的pH

配制130 mmol/L Tris-HCL缓冲液，分成6份，分别调节pH为5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0。

称取脱脂后样品0.1 g，分别加入6 mL上述不同pH的130 mmol/L Tris-HCL缓冲液，振荡混匀，再分别加入15 mg链酶蛋白酶，6组样品于37 ℃下超声振荡提取30 min，然后用10 000 r/min高速离心机离心10 min，过0.22 μm有机滤膜后上机，结果如图4所示，当Tris-HCL缓冲液的pH=7.5时，提取到的硒代蛋氨酸含量达到了最大值，因此采用pH=7.5的130 mmol/L Tris-HCL缓冲液提取。

图4 不同Tris-HCL pH、链酶蛋白酶添加量、提取体积、提取时间下硒代蛋氨酸的含量

2.2.5 优化链酶蛋白酶的用量

称取脱脂后样品0.1 g，分别加入6 mL130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)缓冲液，振荡混匀，再分别加入5、10、15、20、25、30 mg链酶蛋白酶，6组样品于37 ℃下超声振荡提取30 min，然后用10 000 r/min高速离心机离心10 min，过0.22 μm有机滤膜后上机，结果如图4所示，加酶量到15 mg后，随着酶量的增加，提取到的硒代蛋氨酸含量变化很小，因此，考虑到价格因素，将采用15 mg加酶量进行实验。

2.2.6 优化提取剂Tris-HCL缓冲液的用量

称取脱脂后样品0.1 g，分别加入2、4、6、8、10 mL 130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)缓冲液，振荡混匀，再分别加入15 mg链酶蛋白酶，于37 ℃下超声振荡提取30 min，然后用10 000 r/min高速离心机离心10 min，过0.22 μm有机滤膜后上机，结果如图4所示，提取体积为6 mL时，提取到的硒代蛋氨酸含量最高。

2.2.7 优化提取时间

称取脱脂后样品0.1 g，分别加入6 mL 130 mmol/L Tris-HCL(pH=7.5)缓冲液，振荡混匀，再分别加入15 mg链酶蛋白酶，5组样品于37 ℃下分别超声振荡提取10、20、30、40、60 min后离心，过0.22 μm有机滤膜后上机，结果如图4所示，超声时间达到30 min时，已经达到很高的提取效果，且随着时间增加，提取效率并未明显提高，因此，采用30 min作为最终提取时间。

2.3 标准曲线及检出限

配制10、20、40、60、80、100 μg/L系列混合标准溶液，上机检测。其保留时间、线性方程、相关系数及检出限见表1。结果显示该线性方程的线性相关系数r均≥0.999 2，检出限均≤3.0，符合检测需求。

表1 5种硒形态的保留时间、线性方程、相关系数和检出限

2.4 精密度与回收率

本研究以富硒花生Sample1(总硒测定结果为1.24 mg/kg)为实验样品。进行精密度和回收率实验。其结果如表2所示，5种硒形态的加标回收率在89.8%～100.6%之间，精密度RSD/%(n=7)均不超过4.0。

表2 花生中硒形态的精密度与加标回收率(n=7)

2.5 实际样品检测

在仪器条件最灵敏的条件下，用建立的新方法对花生、芝麻、核桃的实际样品进行提取检测。结果如表3所示，样品中提取到的硒形态均为硒代蛋氨酸，且硒代蛋氨酸质量分数为88.0%～96.9%，其中，富硒花生样品1(总硒测定结果为1.24 mg/kg)色谱图见图5，根据保留时间定性可知该花生中硒赋存形态为硒代蛋氨酸。由此可见，这些高脂作物中硒的主要成分为硒代蛋氨酸，同时进一步验证了该方法较高的提取率。

表3 市售富硒花生、芝麻、核桃中硒形态含量

图5 富硒花生样品1中硒代蛋氨酸的色谱图

3 结论

本研究建立了一种高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱联用技术测定高脂作物中5种硒形态的方法，该方法可以在10 min内可以实现5种硒形态的基线分离，且便于操作、经济绿色、提取时间短、提取效率高。目前，鲜见有含油量较高的食品硒形态的检测，本研究可以实现对含油量比较高、提取困难的高脂作物中硒形态的测定，为富硒食品的测定提供技术支持，为市场上富硒食品的规范化提供一定的参考。