有机荧光探针在粮油及其制品检测中的研究进展

李光磊， 龚诗语， 张曼曼， 李 彭， 邓 宇， 孔志康， 邢常瑞， 袁 建

(南京财经大学食品科学与工程学院; 江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心;江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室, 南京 210023)

保障粮油及其制品的安全供应关乎国计民生，然而从生产加工到最后消费的各阶段，都有可能发生有害物质的侵染，这些风险因素包括重金属、添加剂、毒素等，严重危害人民身体健康。因此，建立高效的检测方法，满足各个阶段对安全检测的需求具有重要意义。

很多传统的检测方法，如化学与色谱法，在样品前处理时通常费力耗时，或仪器设备过于昂贵复杂，难以满足快速检测的需求。为了弥补传统检测方法缺陷，应对新的检测需求，多种快速检测方法已被建立，如荧光法、化学发光法、高光谱、表面增强拉曼散射等，这些方法的建立对粮油及其制品中有害物的快速、准确检测和安全控制发挥了重要作用。

荧光探针技术作为独立使用的技术手段或与其他检测技术相结合，在快速检测方法中具有不可替代的重要作用，但有机荧光探针在食品安全检测方面的综述很少。 Duan等[1]总结了有机荧光探针在食品及饮用水中的安全检测的应用进展；Huang等[2]介绍了聚集诱导发光(AIE)类有机荧光探针在食品安全检测的研究进展，重点阐述了AIE探针的分子设计及传感原理。本文聚焦有机荧光探针在粮油及其制品安全检测中的应用，从检测原理出发以检测目标物分类，比较各类探针优缺点，对有机荧光探针在粮油安全检测中的发展方向进行了展望。

1 有机荧光探针在不同类型目标物检测中的应用

1.1 金属离子

金属离子与人体代谢平衡密切相关，摄入不足或过量会引起严重疾病。粮油及其制品是重要的金属营养元素的供给来源，金属元素含量的测定具有极其重要的现实意义。荧光探针为金属离子的检测提供一种快捷、廉价且高效的选择。

如图1所示，Hu等[3]利用二硫苏糖醇(DTT)还原CuSO4制备铜微簇(CuNCs)探针1。金属Al3+引起探针1聚集，引发AIE现象荧光增强，在0.01～7 μmol/L范围内，探针1的荧光强度与Al3+浓度呈现良好线性关系。在油条、薯条、馒头和粉丝等实际样品检测结果与石墨炉原子吸收光谱法(GF-AAS)检测结果高度一致。Jiang等[4]基于β-蒎烯制备了探针2，该探针与Al3+形成配合物后探针分子内电荷转移(ICT)增大从而点亮探针。在pH 1～9的范围内，探针快速(45 s)识别Al3+，其检出限(LOD)为8.1×10-8mol/L。该探针成功用于定量检测薯条、饼干等样品中的Al3+。另外，Guo等[5]利用低聚噻吩制备Cu2+荧光探针3，该探针通过配体特异识别Cu2+离子，从而阻碍了ICT，探针荧光强度减弱(Turn-off型)。探针的响应时间仅为20 s，LOD达到0.42 μmol/L。在稻米等样品检测中，回收率为98.4%～101.4%，相对标准偏差(RSD)小于1.26%。上述各类荧光探针应用于实际粮油样品中金属离子检测，相较于标准的检测方法—原子吸收光谱法，前处理简单，样品经过破碎、酸处理及过滤(或离心)即可直接用于最终荧光检测，适用于快速检测方法的开发。

图1 检测金属离子探针的结构和反应[3-5，7]

目前，多种检测金属离子(Hg2+、Pb2+、Cu2+、Fe2+/ Fe3+、Zn2+等)的有机荧光探针已经被制备，并应用于体内、体外检测[6]，在粮油及制品中金属离子的检测应用主要局限于Al3+和Cu2+，有害重金属如Pb2+、Cd2+、As的检测应用鲜有报道。Hafuka等[7]报道了利用有机荧光探针4检测糙米中Cd2+的方法，但该检测方法在常规的破碎、消化前处理外还需要通过阴离子交换树脂纯化提取Cd2+，预处理过程等较复杂。因此，急需构建更多适用于检测粮油食品中不同种类金属离子的探针，特别是用于检测重金属离子的荧光探针。

1.2 阴离子

与金属阳离子类似，阴离子与人体的健康也息息相关。粮油食品在加工过程中的食品添加剂，如高剂量的亚硫酸盐/亚硫酸氢盐可引起过敏反应、哮喘恶化和神经系统紊乱；氰化物的过量积累会对机体造成不可逆损伤。因此，粮油制品中阴离子的种类及含量需要精确测定。

1.2.1 SO32-/HSO3-

多个国家或组织对食品中SO32-/HSO3-的量做了严格的规定。联合国粮农组织(FAO)/世界卫生组织(WHO)认为可接受的每日摄入量应低于0.7 mg/kg体重，因此严格的摄入管理非常必要。

基于不同识别方式，如迈克尔加成、与醛特异反应、AIE效应等，多种检测SO32-/HSO3-的荧光探针已经被制备。迈克尔加成的反应条件一般较温和，这类探针通过碳碳双键与SO32-/HSO3-结合，导致原本的共轭体系或ICT改变，最终导致荧光信号发生变化。如图2所示，Li等[8]设计了一种检测糖样品和活体细胞中HSO3-的荧光探针5，HSO3-与探针分子双键发生迈克尔加成反应，使得探针的可见色度及荧光颜色都发生改变。和普通的荧光探针相比，近红外(NIR)荧光探针具有更好的信号穿透能力和更低的噪音背景，这类探针受到很高关注。Li等[9]基于典型的荧光材料—半花菁骨架设计了NIR Turn-off荧光探针6，HSO3-通过迈克尔加成与探针亚乙基中的C-4原子反应，破坏了探针的共轭体系，导致705 nm处的荧光强度逐渐降低。该探针在糖类和红酒样品的检测结果与传统滴定检测结果几乎相同，回收率达到96.7%～106.1%。与之相对，Duan等[10]设计了NIR Turn-on型探针7，SO32-攻击探针的喹啉骨架，使得其原本的吸电子性基团转变为强给电子基团，探针近红外荧光信号增强。该探针响应时间短(少于50 s)，LOD低(31.6 nmol/L)，并成功应用于砂糖及挂面中SO32-的检测。

图2 检测阴离子探针的结构和反应[8-24]

不同于强度变化型探针，双信号的比率定量不易受到探针浓度、局部微环境等因素干扰，具有更好的抗干扰能力。Asaithambi等[11]将2个半花菁骨架引入到1个化合物中制备了探针8和9，探针在初始状态分别发出625 nm和640 nm的红色荧光，当与SO32-/HSO3-反应，荧光信号蓝移至500 nm和510 nm。LOD分别为1.8、2.1 nmol/L, 成功用于挂面等实际样品检测。Li等[12]和Zhang等[13]分别基于半花菁制备了检测SO32-/HSO3-的NIR比率型荧光探针10和11，SO32-/HSO3-的结合破坏了探针分子10和11的π共轭体系及改变ICT，从而使得探针分子双荧光信号改变，SO32-/HSO3-的含量由双荧光信号比率定量。探针成功用于糖类样品及细胞内检测。Huang等[14]报道了另外一类比率定量检测SO32-荧光探针12，SO32-破坏了苯并吡喃和萘酰亚胺之间的荧光共振能量转移(FRET)，从而使得供体信号荧光(570 nm)变强，同时受体荧光(650 nm)减弱，LOD为0.017 μmol/L，在豆腐皮和冰糖样品的检测中回收率为94%～103%。基于HSO3-与醛的亲和加成反应，Feng等[15]等设计了一个双光子荧光探针13，该探针与HSO3-结合后，抑制了探针分子内ICT效应，荧光强度随HSO3-的浓度升高逐渐淬灭，LOD达到42 nmol/L，在糖类样品的检测中表现出了很高的回收率。Gao等[16]构建了具有AIE增强现象的四苯基咪唑化合物14。该化合物自组装成高度有序的纳米颗粒，并显示强烈荧光。随着0到1个当量SO32-的加入与探针结合，原本有序组装的纳米颗粒变成无序状态，从而导致荧光强度逐渐降低。该纳米颗粒用于SO32-检测具有极短的检测时间(15 s)以及很低的LOD(7.4 nmol/L)，在砂糖样品检测的回收率为96.8%～102.4%。

多种类型的SO32-/HSO3-荧光探针被用于实际样品检测，其LOD远低于比色法，且响应迅速，具有非常好的应用前景，但目前尚缺乏能快速高效区分食品中SO32-和HSO3-的荧光探针，这将是未来的一个研究关注点。

1.2.2 氰化物(CN-)

CN-被认为是毒性最强的阴离子之一，它会抑制细胞呼吸、扰乱中枢神经系统。其在塑料生产、药物开发等行业仍被广泛应用，另外包括木薯、竹笋、杏仁等食品也会产生内源的CN-。

以罗丹明B类似物为基本结构，Long等[17]报道了荧光探针15，在水溶液中CN-的存在会使探针分子的羟基去质子化，从而开启ICT，探针分子荧光增强，LOD达0.5 μmol/L以下，并成功用于如发芽马铃薯、苦杏仁及自来水等实际样品检测。与该探针的识别原理类似的还有Wei等[18]报道的吩嗪类探针16，Mahalakshmi等[19]制备的萘醌类探针17，以及Niu等[20]报道的探针18。值得注意的是，该类探针与CN-形成去质子化的溶液可被HCl重新质子化，从而恢复原始状态(自由态)，因此通过固定化探针的方法，有望对探针多次重复利用。

低聚噻吩也被用于构建CN-荧光探针，Niu等[20-23]报道了turn-on型探针19和20。CN-通过亲和加成反应破坏了探针分子内电子供体(低聚噻吩基团)与电子受体间的共轭双键，从而抑制了分子的ICT，探针荧光增强。特别值得一提的是探针20的LOD达到31.3 nmol/L，且检测时间仅为30 s。探针成功用于检测土豆、木薯和芋头等粮食作物样品中CN-含量。

Long等[24]构建了NIR比率型荧光探针21，CN-与探针分子的吡咯烷的结合，阻碍了探针分子内的ICT，使得荧光发射波长蓝移。在CN-浓度0～80μmol/L范围内，探针在519 nm处与688 nm处的荧光强度之比呈很好的线性关系。该近红外CN-探针被用于检测发芽马铃薯等多种食品样品，LOD为0.075 μmol/L。并且该探针还被成功用于制备荧光比色试纸，使得检测更加便捷。

食品中定量检测CN-的国家标准(GB 5009.36—2016)为分光光度法和LC，其中分光光度法需要较为复杂的前处理，而CN-在LC检测前还需要用氯胺-T衍生，操作烦琐。荧光探针是检测CN-最简单、经济和快速的方法之一。

1.3 有机物

食品中的外源有机物包括违规添加的食品添加剂、非法添加物、加工过程中生成的有害物质及污染物等，如面粉中的非法添加物过氧化苯甲酰、豆制品及海鲜中非法使用的甲醛、深度油炸油中的三酰甘油聚合物等。

1.3.1 过氧化苯甲酰(BPO)

BPO是一种小分子活性氧(ROS)，由于其氧化漂白作用被广泛用于食品加工业。BPO可通过食品摄入或皮肤吸收进入体内，造成潜在风险。2009年，食品法典委员会(CAC)规定了小麦粉中BPO的最大使用量为75 mg/kg[25]，中国及欧盟禁止在小麦粉中使用BPO，其含量的精确检测对保障食品安全具有非常重要的意义。

如图3所示，Zeng等[30]报道了2种检测BPO的香豆素类荧光探针22和23。其中探针22的碳碳双键作为与BPO反应的特异活性位点，探针氧化分解，探针荧光由红色变为蓝色。BPO含量可通过470 nm与655 nm处荧光强度比定量，该探针响应时间快(< 6 min)，LOD为163 nmol/L。探针23以频哪醇硼酸酯为识别基团，通过与BPO的选择性氧化反应，引发分子内随后自发的消除反应，ICT减弱，导致探针荧光颜色由红色变为绿色，探针的响应时间比探针22稍长(< 15 min)，但LOD更低(56 nmol/L)。2种探针在小麦粉、面条和饺子粉等实际样品中检测均不需要复杂前处理，但探针23检测实际样品时的回收率仅为30.4%～66.7%，远低于探针22的90%～114%，Zeng等[30]推测可能是由于探针23的识别基团频哪醇硼酸酯可以与淀粉链中的羟基结合，干扰了探针对实际样品中BPO的高选择性。同样以频哪醇硼酸酯为识别基团，Tian等[28]在半花青骨架的基础上制备了NIR探针24，其识别检测原理与探针23类似，该检测限达到47 nmol/L，并且在小麦粉样品的实际检测中有很高的回收率(平均偏差 < 3%)。基于相同识别基团，Ding等[29]设计了推拉电子(D-π-A)结构的双光子荧光探针25，探针在小麦粉检测中回收率为93%～105%，同样未出现探针23较低回收率的问题。可见，合理的探针设计可以避免样品基质中羟基对频哪醇硼酸酯识别BPO的干扰，但相应机制尚不明确，如何实现理性化设计有待研究。

图3 检测有机物探针的结构和反应[26-33，35-36]

基于BPO的氧化性，Zeng等[30]设计了可同时检测HSO3-和BPO的荧光探针26。探针以吩噻嗪为主体结构，吩噻嗪骨架上的硫原子若被BPO氧化成亚砜，探针产生一个荧光开启信号。在小麦粉和面条样品中的检测回收率为90%～103%。该探针被制备成检测BPO的纸基试纸条，当暴露于不同浓度(0～150 μmol/L)的BPO 10 min，纸基试纸从无荧光变为强绿色荧光。纸基试纸条进一步简化了探针检测操作，有利于在基层和现场推广应用。

1.3.2 甲醛(FA)

FA是一种活性羰基物质(RCS)，常被用作防腐剂或用来改变食品颜色和气味(很多时候是违法的)。2011年5月我国颁布的《食品添加剂使用标准》不再将FA列为食品添加剂范畴。为了降低FA可能带来的危害，早期检测对于FA浓度的控制尤为重要。

FA非常容易与胺衍生物发生反应，-NH2常常被用作FA的识别基团。Xu等[31]制备了一种简单的萘基荧光探针27，探针的-NH2识别FA后，探针通过2-Aza-Cope重排及水解反应生成具有吸电子性质的醛基，从而形成电子推拉体系，ICT增强，探针荧光强度增加。LOD为0.57 mmol/L，在实际样品太妃糖中的检测结果与HPLC检测结果一致。Zhou等[32，33]报道了2种基于-NH2识别基团及光致电子转移(PET)原理用于检测食品FA的探针28和29。探针28 是具有双发射增强型的FA反应分子，在近100%水溶液中，探针的-NH2与FA反应形成的亚胺，抑制了分子原本的PET，荧光增强。探针分别在 365 nm和 400 nm 处激发，在415 nm和505 nm处显示荧光响应。2个激发波长强度都定量检测FA浓度，但400 nm激发获得了更宽的FA定量检测范围(0～2.7 × 10-2mol/L)，LOD为6 μmol/L。当探针29与FA反应，-NH2转化为亚胺，使得荧光团HOMO能量低于喹啉的HOMO能量，原本的PET过程受到抑制，荧光增强，LOD低至900 nmol/L。此外，通过静电纺丝技术制备了含有聚乙烯醇和探针的纳米纤维，使检测更加简便。这2个探针初步成功应用于豆腐皮等实际样品中FA的检测。

1.3.3 其他

高温油炸过程会发生包括水解、氧化和聚合等许多复杂的反应，并产生具有潜在毒性物质。其中三酰甘油聚合物含量代表食用油的聚合程度，被广泛用于评价食用油品质控制、初榨油鉴别和油氧化[34]。

Wu等[35]报道了AIE探针30，该探针通过煎炸油中的黏度介导机制检测三酰甘油聚合物。在高温油炸过程中，氧化反应生成氧化三酰甘油单体(ox-TGM)，聚合生成三酰甘油二聚体和低聚物，导致油炸油的黏度增加，限制了探针分子内运动，阻碍了非辐射衰变，荧光发射增强。在3.5%～11.75%范围三酰甘油聚合物的浓度与探针荧光强度线性相关，探针1 min内完成检测，检测结果与目前食品行业的国家标准方法HPLC分析结果高度一致，表明了该探针在粮油检测应用中的可行性。

联氨广泛用于军事、航天、药物合成等领域，但联氨对生物体具有高毒性。美国环境保护署(EPA)确定最低浓度为10 μg/kg的联氨是一种潜在致癌物，因此需建立灵敏的检测方法追溯联氨在环境和食品中的富集。

Qi等[36]制备了联氨探针31，醋酸酯基团与联氨反应而分解，基于激发态分子内质子转移(ESIPT)机制探针荧光强度增强。该探针具有宽的线性范围(0～20个当量)以及高选择性。探针在淘米水中联氨检测结果表明探针应用不易受检测环境影响。

1.4 真菌毒素

粮油中的真菌毒素以黄曲霉毒素和赭曲霉毒素最具代表性，常见于谷物、油籽等食品中[37]。黄曲霉毒素B1(AFB1)在黄曲霉毒素系列中毒性最强，具有致突变、致畸、和致癌作用，被国际癌症研究机构(IARC, 2002)归为I类致癌物[38]。赭曲霉毒素中以赭曲霉毒素A(OTA)最普遍，毒性最强，具有潜在肾毒性。

如图4所示，Jia等[39]报道了用AIE探针与氧化石墨烯构建的适配体传感器32。在没有 AFB1的情况下，探针与适配体聚集复合物通过静电相互作用吸附在氧化石墨烯表面，由于氧化石墨烯的淬灭效应，不发射荧光。而在AFB1存在的情况下，适配体与AFB1结合，进而从氧化石墨烯表面释放，荧光发射增强。该检测可以通过简单地混合探针、适配体、氧化石墨烯及待检测样品，操作简便。并且该传感器对食品中的其他黄曲霉毒素具有高度选择性，在已知浓度的食品样品(玉米、大米等)中得到验证，LOD为0.25ng/mL。Xia等[40]利用双末端茎状适配体信标和AIE探针构建了AFB1传感器33。该适配体信标保护适配体探针不被外切核酸酶 I (Exo. I) 水解，并能够特异性识别AFB1。Exo. I是一种核酸酶，可以催化从3'末端起始的单链DNA中去除核苷酸，即体系没有AFB1时，该配体信标结构可避免适配体探针被Exo. I水解，带正电荷的AIE探针会聚集在带负电荷的DNA上而点亮；当AFB1存在时，AFB1与适配体竞争结合，导致双链适体信标的结构转化为两条单链暴露3'末端而被Exo. I水解，AIE探针无法聚集，从而荧光信号低。该检测方法成功应用于花生油和蚕豆酱中AFB1的分析，在实际样品检测应用中，样品仅需简单的提取和离心的预处理程序，总回收率为92.75%～118.70%。Zhu等[41]通过相同的AIE探针和酶消化过程的协同设计了赭曲霉毒素适配体传感器34，由单链DNA设计了OTA适配体。当溶液中没有目标分子OTA时，探针适配体被Exo. I酶解，探针无法聚合，显示微弱荧光信号；当溶液中存在目标分子OTA时，适配体会与目标OTA结合，适配体3'末端被隐藏，抵抗Exo. I酶消化过程，此时目标OTA的结合将导致适体序列的更大保留，探针荧光被点亮。该传感器的LOD为0.4 ng/mL。文章仅展示了在红酒和咖啡样品中的检测应用，未涉及粮油及其制品，但该探针的特异性实验显示了该检测器在不同检测基质中的应用可能。

图4 检测AFB1和OTA探针的结构[39-41]

2 总结与展望

本文重点介绍了有机荧光探针的最新研究进展及其在粮油食品检测中的应用。基于有机荧光探针的传感技术表明，有机荧光探针可以有效检测粮油食品中多种内源和外源污染物，在完善粮油检测体系方面具有巨大潜力。

然而有机荧光探针在粮油检测应用上仍然面临一些挑战，主要原因在于粮油及其制品通常样品基质复杂，存在难以预计的干扰及较多的背景噪音。因此在探针的设计及应用时应当注意：首先，探针荧光波长应与检测基质荧光波长有显著差别或选择不会产生内源荧光的化学发光探针，降低检测基质中的背景荧光的影响。其次，相较于开关型探针，比率型探针通过双波长检测，具有更好的抗干扰能力，因此应注重发展颜色显著变化的比率型探针。再次，探针的选择性识别是准确检测的前提，因此迫切需要针对检测物精确设计具有高选择性的探针，特别是应该注重与常用的特异识别技术的结合，如抗体抗原反应、适配体识别、分子印迹、核酸杂交技术等。另外，荧光探针技术在粮油领域的应用仍然处在早期阶段，在荧光探针的开发过程中，应注意探针的成本、毒性等问题。

有机荧光探针在粮油及其制品检测领域取得了快速的发展，但在广泛应用于实际领域之前仍存有很多工作需要做，这些工作的完成需要多领域不同学科的密切合作。