PCR 法检测WSSV 出现假阳性和非特异性条带的原因分析及解决方法

吴学芳，李 微

(1.昆山市玉山镇农业服务中心，江苏 昆山 215316；2.昆山市水产技术推广站，江苏 昆山 215300)

套式PCR法检测白斑综合征病毒(WSSV)因操作简便、灵敏度高等优点而被县级实验室广泛应用。但基层实验室由于缺少专职实验操作员、管理较为松散等原因，经常出现假阳性和非特异性条带问题。近年来，农业农村部每年开展水生动物防疫系统实验室检测能力验证工作，要求已经建成运行的县级水生动物防疫站至少参加一种疫病的实验室能力验证项目。白斑综合征(WSD)由于发病率高、引起水产动物死亡率高从而成为众多县级实验室选择的检测项目。

昆山市水生动物疫病预防控制中心自2015年起开展WSSV的实验室检测工作，参照《白斑综合征(WSD)诊断规程第2部分：套式PCR检测法》(GB/T 28630.2-2012)严格执行。然而，在实验过程中，经常会出现假阳性和非特异性条带。笔者与江苏省内多家县级水生动物防疫站交流后发现，以上两个问题在多家实验室普遍存在。本文对套式PCR法检测WSSV假阳性和非特异性条带两个问题形成的原因加以分析，并提出预防和解决方法，旨在为广大基层实验室提供参考。

一、假阳性

1.形成原因

套式PCR的原理是采用两步法进行目的片段的扩增，第二步PCR以第一步PCR反应产物为模板。这种方法检测灵敏度非常高，即使在反应体系中出现了极其微量的模板污染，也会造成假阳性。

(1)首次假阳性。由于县级防疫实验室的检测人员并非专职实验操作员，一般为当地水产技术推广部门的工作人员兼职负责，所以在操作过程中，可能会出现枪头非一次性使用、动作幅度过大、手套未及时更换、PCR阳性产物不慎溢出等不当操作，这些都是导致假阳性的原因。

(2)非首次假阳性。往往出现一次假阳性后，随着短期内实验次数的增加，假阳性发生的概率也会随之加大，这是由于在首次出现假阳性后，实验操作台、仪器设备和试剂耗材均有可能被污染，空气中也可能存在目的片段气溶胶颗粒。

2.预防措施

假阳性一旦出现则很难消除，做好预防工作是十分必要的，具体做好以下3点。

(1)规范实验操作。县级防疫站要加强对实验操作人员的理论培训和实操培训，使其增强意识和提升操作能力，尽可能地减少污染发生。特别要加强对移液器规范使用的培训，很多污染都是由于移液器使用不当造成的。

(2)严格实验分区。严格区分样品处理室、反应体系配制室、PCR扩增室和电泳室等。实验分区的好处是一旦出现污染，可控制在某一单独区域或少数区域，而其他区域仍可正常使用，大大提高后续实验的成功率。

(3)重视消毒。在每次PCR实验结束后都要消毒，地面和工作台面用含氯消毒液擦拭，仪器设备要用75%酒精擦拭。此外，在实验开始前，要对用到的吸头、离心管等进行高温高压灭菌消毒。

3.解决方法

发现WSSV假阳性现象后，可采取以下几条措施加以解决。

(1)整体空间用紫外灯照射。消毒液和高温高压灭菌消毒仅能灭活WSSV，并不能破坏目的片段DNA分子。在出现假阳性后，县级实验室可使用移动式紫外灯对各实验区域分别进行照射消毒，使DNA分子断裂，从而降低假阳性发生的概率。

(2)加强通风。在假阳性出现后，实验员往往会继续开展多次实验以求达到正确的实验结果，这样就会造成一定空间内目的片段DNA分子浓度的不断升高，假阳性现象不但没有消除，还会愈加严重。在发生这种情况时，除无菌操作间外，其他区域要及时打开门窗通风，保证通风数小时以上，以达到稀释污染物的目的。

二、非特异性条带

1.形成原因

套式PCR法检测WSSV，虽然特异性较高，但有时也会出现非特异性条带的扩增现象，这些非特异性条带一般为多条，浓度较低。由于实验采用国标法，所以排除引物设计不合理和退火温度不合适这两个因素，主要考虑以下因素。

(1)模板不纯。DNA提取方法不合适或者实验操作不当，引起模板中含有组蛋白、Taq酶抑制剂等杂质。

(2)酶失活。Taq酶保存不当，造成酶活性降低或者失活。

(3)引物问题。引物质量不好或者两条引物浓度一条高一条低，造成低效率的不对称扩增。

2.预防和解决方法

相较于假阳性，非特异性条带问题可较好预防和解决。实验人员平时要注重Taq酶的低温保存，酶要存放于-20℃，并每年重新采购，以防过期失活。稀释引物时，要严格按照国标法规定的浓度进行稀释，不得随意更改浓度。引物应分装后低温保存，切忌反复冻融造成降解。

实验室日常运行过程中要规范管理，保证室内环境的清洁，并安排专人负责仪器设备的维护和试剂管理。PCR实验需由经过系统培训的人员完成。在出现假阳性或非特异性条带问题后，要及时分析原因，消除不利因素，以保证获得正确的实验结果，提高为养殖生产服务的能力。