板栗组织培养及褐变研究

□文/李婧实 周丽艳 睢金凯 程晓园

板栗原产地是在中国，是世界上非常受欢迎的干果之一。板栗果实营养丰富，风味独特。常见的板栗产品有烤板栗、速冻板栗粒、板栗罐头、板栗汁、板栗饮料等，深受市场消费者的喜爱。

一、板栗的营养和药用价值

板栗富含人体所需的营养素和微量元素。新鲜板栗果实的碳水化合物含量远远高于其他同类产品，因此可以替代基本食物，为人体提供热量。栗子也富含蛋白质。板栗和板栗皮的脂肪含量普遍，但大部分为不饱和脂肪酸。板栗中的微量元素含量也高于普通水果，尤其是铁、锌和钾。板栗具有很高的药用价值。板栗中所含的微量元素对预防骨质疏松有很好的作用。不饱和脂肪酸在对血脂进行调节、减少血栓形成、预防心血管疾病方面发挥着积极作用。根据中医的食物同源理论，常吃栗子可以强筋健肾，其效果与人参、当归相当［1］。

二、板栗组织培养

近年来，板栗品种的选育也有了极大的改善，优良栗子的供应迫在眉睫。通过运用组织培养技术能够有效地解决这些技术问题，但其效果还有一定的不足。以燕山低日红板栗种子为例，诱导异种分枝，生根率为53.7%，进行体外覆盖。目前，还没有直接利用茎尖、腋芽、树干和叶片等营养器官作为解释性再生系统，进行板栗的扦插以及组织培养时，生根比较困难，其根源尚不清楚。一些人认为栗子幼苗或小枝中的过量现象是导致抑制根系生长缓慢的重要原因，但还缺少一定的数据支持［2］。与其他果树进行对比，板栗组织培养的研究相对落后，这也让板栗基因工程的研究存在很大的困难。美国、欧洲、日本等国运用板栗的腋生繁殖，进行无根播种，能够有效地降低发病率。我国对板栗栽培技术的研究较少。以往的实验结果表明，板栗再生系统中的形态发生结合是限制板栗组织培养快速增殖的主要因素。组织无法区分外来分枝，增殖的无根幼苗生根的困难性比较大，同时在体细胞胚发育的过程中，很难区分细胞极性。因此，为了能够促进板栗形成快速繁殖体系以及再生体系，不仅需要对板栗离体培养的技术进行研究，还需要不断的探索板栗离体生长的调控机制，更好的推动板栗离体生长，有效提升板栗的组织培养水平［3］。

三、板栗组织培养中的褐变问题

在板栗组织培养中，褐变会引起外植体的反分化或再分化，从外植体表面释放棕色物质到培养基中，使培养基逐渐变褐，外植体进一步褐变死亡。外植体通常是指从板栗切下的组织或切片，用于创建、生长或进行克隆板栗的组织培养。当传代培养时，培养的组织片段在转移到新鲜培养基时被称为外植体。褐变在板栗组织培养过程中是经常会发生的情况，褐变、真菌污染和水分过多（即玻璃化）被认为是板栗组织培养中的三大问题。因为控制褐变比控制污染和水分过剩更难，有效控制褐变也是进行板栗组织培养成功的秘诀。褐变一般是在外植体中出现，常发生在板栗愈伤组织传代、悬浮细胞培养以及原生质体分离培养的过程中，褐变会对外植体、细胞、培养基以及多种酶、培养物的生长和分化有抑制作用，甚至死亡。

四、板栗组织培养发生褐变的原因

褐变主要可以划分为酶促褐变以及非酶促褐变，在板栗组织培养中，褐变主要是由酶的引起。酶促褐变需要满足三个条件：酶、基质和氧。引起褐变的酶主要有多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）和苯胺氨酶（PAL），其中比较重要的是PPO酶，也是引起褐变的主要因素。引起褐变的酶基质主要由酚组成，在正常发育的植物组织中，基质、氧和PPO的存在不会引起褐变。这是因为在普通组织细胞中，多酚在细胞液泡中很常见，PPO在每个细胞中都很常见。在种子或细胞组织中，由于这样的区域分布，PPO不能进入基质，当细胞膜结构发生变化和破坏时，创造酶和PPO接触的条件，在有氧的情况下，酚被氧化为醌，发生了一系列脱水和聚合物反应。最终形成了一种深棕色物质，发生了褐变现象。

五、克服板栗褐变的措施

1.选择合适的板栗培养条件

对外植体进行合理的选择，构建最佳的培养环境，也是阻止板栗发生褐变的重要方式。外植体的褐变程度随时间和年龄的不同而不同，成年的树木褐变程度较苗木严重，夏季材料褐变程度较冬、早春、秋季严重。介质的选择性也必须适当，注意介质的状态类型，培养基的组成，如矿物盐、蔗糖浓度、激素水平和组合也应适当。

2.添加褐变抑制剂和吸附剂

在组织制备过程中，通常在培养基中加入抗氧化剂和吸附剂，以对抗酶对外植体的影响。在培养基中通过添加抗氧化剂，能够改变外植体周围的环境，组织酚氧化，有效的减少褐变。现阶段，在组织培养中通过能够使用的抗氧化剂种类比较多，需要进行合理的选择。

3.其他褐变预防措施

褐变外植体材料的连续转移和预处理可以降低醌类对培养物的毒性作用。接种1～2天后，芽尖长出，将组织转入到新培养基。接种12～24小时后，需要转移到液体的培养基中，每天接种一次，持续1周以抑制褐变。外植体用流水冲洗干净后，放入5℃左右的冰箱中，低温处理12～24小时，进行灭菌，然后，先将外植体放置到含蔗糖的培养基中培养，连续7天，从培养基中取出外植体，使外植体中的酚类物质部分浸润，浸入0.1%的漂白粉溶液10分钟，再接种到合适的培养基中，有效防治褐变［4］。

结语：

板栗分布在世界各地，具有很高的经济价值。为了充分利用板栗资源的效益，探索板栗的种植优化，已成为板栗资源保护、开发以及可持续利用的重要研究方向。