基于网络药理学探讨阿朴菲类生物碱抗抑郁的作用机制

王志慧，乔卫

（天津医科大学药学院天然药物学系，天津 300070）

抑郁症是一种常见的精神障碍疾病，其临床表现主要有持久性的心情低落、快感缺失、焦虑失眠，严重者甚至会出现自杀或自残倾向[1]。抑郁症临床症状多样化，病因尚不明确，其发病涉及多种机制，其中神经炎症[2]、下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴失调[3]、单胺类神经递质水平失调[4]、神经营养因子水平改变[5]以及代谢途径[6]等被认为与抑郁症的发生密切相关。目前抗抑郁的药物以西药为主，主要有三环、四环类抗抑郁药物（如阿米替林）、5-羟色胺再摄取抑制剂（如帕罗西汀）以及5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂（如文拉法辛）等。但是抗抑郁西药在临床使用中经常产生一些不良反应，尤其是在长期服用的情况下。这就需要寻找并筛选有效安全的抗抑郁药物[7-8]。

阿朴菲类生物碱属于异喹啉类生物碱，是天然生物碱的一个重要类型，在自然界中分布广泛且具有多种药理活性。研究表明，阿朴菲类生物碱具有抗菌[9]、抗癌[10]、抗血小板聚集[11]以及多种神经系统作用如对神经细胞的保护作用[12]、抗抑郁作用[13]等。本文应用网络药理学结合分子对接的方法对部分阿朴菲类生物碱的抗抑郁作用进行预测。并对作用靶点与信号通路进行整合分析，构建阿朴菲类生物碱成分-抑郁症靶点-通路网络图，阐明其抗抑郁的作用机制。

1 材料与方法

1.1 阿朴菲类生物碱代表性化合物收集 通过检索CNKI、Pubmed、CAS等数据库收集阿朴菲类生物碱代表性化合物。

1.2 阿朴菲类生物碱潜在作用靶点的预测及筛选 根据已知41个阿朴菲类生物碱成分的化学结构，利用Chem Bio Draw Ultra18软件画出化学结构，并以sdf格式保存，将sdf文件上传至Swiss Target Prediction数据库，物种选择为Homo sapiens，获得每个活性成分的预测靶点。将所有化合物的靶点进行整合，删除重复值得到所有成分的总靶点。

1.3 抑郁症相关靶点筛选 将“Depression”为关键词在Gene Cards数据库中进行检索，寻找与抑郁症相关的潜在靶点。在此数据库中Score值表示该靶点与疾病关系，Score值越大代表该靶点越重要，因此本次筛选设定大于5分的目标靶点作为抑郁症的潜在作用靶点。

1.4 阿朴菲类生物碱成分与抑郁症靶点的交集 将阿朴菲类生物碱成分的作用靶点与抑郁症的相关靶点导入Venny2.1.0，得到阿朴菲类生物碱成分与抑郁症的交集靶点，绘制韦恩图。

1.5 阿朴菲类生物碱成分-抑郁症靶点蛋白相互作用PPI网络图构建 将1.4中得到的交集靶点上传至STRING数据库，选择物种为“Homo sapiens”，设置“minimum required interaction score”为“highest confidence（0.700）”，隐藏游离节点，其余参数默认。获得并下载交集基因的PPI网络，保存tsv格式文件。将结果导入到Cytoscape3.7.2得到PPI网络图。

1.6 GO和KEGG富集分析 将得到的交集靶点导入DAVID平台进行GO富集功能分析，包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）以及分子功能（MF），并进行KEGG通路富集分析。以P<0.01为显著性阈值。另外再对P值从小到大排列，选出P值最小的前10个BP、CC和MF进行GO富集功能分析并绘制条形图。筛选出P值最小的前10条KEGG通路，并绘制气泡图。

1.7 成分-靶点-通路网络图构建 将41个有效成分，78个交集靶点和84条通路导入Cytoscape3.7.2得到阿朴菲生物碱成分-抑郁症靶点-通路网络关系图，并用软件中的Network Analyzer工具进行拓扑分析，用Dgree值参数判断阿朴菲类生物碱抗抑郁的主要活性成分和关键靶点通路。

1.8 分子对接 将PPI网络图中的关键靶点蛋白与成分-靶点-通路网络图中的活性成分导入Autodock 1.5.6，得到对接分数。之后利用pymol 2.3.1绘制蛋白配体3D结构。

2 结果

2.1 阿朴菲类生物碱成分 通过检索数据库收集并筛选阿朴菲类生物碱成分，最终获得41个成分，如表1所示。将41个活性成分导入Swiss Target Prediction数据库获取预测基因靶点，删除重复值之后一共有662个总靶点。

表1 阿朴菲类生物碱成分信息Tab 1 Information of aporphine alkaloids constituents

2.2 阿朴菲类生物碱-抑郁症相关靶点 从Gene Cards数据库中共获得12 812个与抑郁症相关的靶点，由于靶点数目过多，所以将条件设为Score值≥5，将小于5的靶点剔除，筛选后得到342个靶点。将阿朴菲类生物碱活性成分的662个靶点与抑郁症342个靶点导入Venny2.1.0得到成分-疾病交集靶点（图1），从图中可以看出二者交集靶点有78个。

图1 阿朴菲类生物碱成分—抑郁症靶点Fig 1 Aporphine alkaloids constituents—depression targets

2.3 阿朴菲类生物碱-抑郁症相关靶点PPI网络图 将78个交集靶点上传至STRING数据库得到蛋白互作关系，将结果导入Cytoscape3.7.2得到PPI网络图（图2），该网络图包含73个节点，216条边。根据网络图中Degree值的大小即节点的大小和颜色深浅判断靶点与疾病的关系，节点越大，颜色越深代表Degree值越大，意味着该靶点可能与阿朴菲类生物碱抗抑郁作用的关系越密切。由图中可以看出同心圆内圈靶点Degree值较大，其中N-甲基-D-天冬氨酸受体亚基基因（GRIN1）、5-羟色胺（5-HT）转运蛋白（SLC6A4）、儿茶酚氧位甲基转移酶基因（COMT）、单胺氧化酶A（MAOA）、蛋白激酶B1（Akt1）是Degree值最大的前5个靶点，这5个靶点可能与阿朴菲类生物碱抗抑郁作用有很大相关性。

图2 阿朴菲类生物碱-抑郁症靶点PPI网络图Fig 2 PPI network of aporphine alkaloids constituents depression targets

2.4 靶点GO功能和KEGG通路富集分析 为了进一步研究阿朴菲类生物碱抗抑郁的作用机制，将交集靶点导入DAVID平 台（https://david．ncifcrf．gov/），进行GO（gene ontology）生 物 学 过 程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、和细胞定位（cellular component，CC）3种基因功能分析以及KEGG（Kyoto encyclo-pedia of genes and genomes）信号通路富集分析。通过筛选，得到符合条件的BP、CC、MF，富集前10位，利用微生信绘制条形图（图3），同样取筛选出的前10条通路绘制气泡图（图4）。

图3 GO-BP、GO-CC、GO-MF分析结果条形图Fig 3 Bar graphs of GO-BP、GO-CC、GO-MF analysis results

图4 KEGG富集分析通路图Fig 4 Pathway diagram of KEGG enrichment analysis

2.5 阿朴菲类生物碱成分-抑郁症靶点-通路网络图构建 将41种阿朴菲类生物碱成分、交集靶点以及通路导入Cytoscape3.7.2，应用Network Analyzer进行拓扑分析，绘制成分-靶点-通路网络（图5），如图所示，共有203个节点，1 450条边。方形代表成分，圆形代表交集靶点，菱形代表通路。图中节点越大，颜色越深代表Degree值越大。结果可知，roemerine、menisperine、cassameridine、（-）-Nmethylasimilobine以 及N-methylactinodaphnine的节点较大，颜色较深，表明这5种化合物通过多个靶点，多条通路，进行疾病治疗。图中基因Degree值排名靠前的5个分别为MAPK1、MAP2K1、Akt1、PIK3R1、糖原合酶激酶-3B（GSK-3B），其中Akt1也是蛋白互作网络中的主要基因，表明AKT1基因可能是阿朴菲类生物碱抗抑郁的关键作用靶点。通过网络图可以看出不同活性成分通过多靶点、多通路进行抗抑郁作用。

图5 阿朴菲类生物碱成分-抑郁症靶点-通路网络图Fig 5 Aporphine alkaloids constituents-depression targets-pathway network diagram

2.6 分子对接 将PPI网络中的关键靶点与网络图中的关键化合物进行分子对接，对接结果见表2，对接结构图见图6。结果显示，阿朴菲类生物碱代表性化合物和关键靶点之间均具有一定的亲和力，莲碱（Roemerine）与COMT结合力最强而蝙蝠葛林碱（menisperine）与SLC6A4的结合力最强。进一步证实阿朴菲类生物碱代表性化合物可以作为潜在的抗抑郁候选药物。

图6 Roemerine与COMT(1)、menisperine与SLC6A4(2)的对接结果图(左)及对接模式图(右)Fig 6 Docking results(left)and docking pattern(right)of roemerine-COMT(1)and menisperine-SLC6A4(2)

表2 阿朴菲类生物碱代表性化合物与关键靶点分子对接结果Tab 2 Molecular docking results of aporphine alkaloids constituents with key target

3 讨论

抑郁症因其病因及发病机制复杂，目前临床治疗尚未取得满意的效果，阿朴菲类生物碱是自然界中分布广泛且具有重要生物活性的一类生物碱[14]。已有研究结果表明部分阿朴菲类生物碱具有抗抑郁活性[13，15-17]。本文通过查阅文献找出41个阿朴菲类生物碱，包括莲碱、木兰花碱、阿扑吗啡、酸李碱等。

本研究通过网络药理学方法探讨阿朴菲类生物碱治疗抑郁症的分子作用机制。筛选出阿朴菲类生物碱抗抑郁有效性成分、作用靶点以及通路。由PPI网络图可知预测到的73个靶点中GRIN1、SLC6A4、COMT、MAOA、AKT1等靶点基因可能是阿朴菲类生物碱治疗抑郁症的主要靶点。GRIN1是NMDA的一个关键亚基，具有高钙渗透性和对镁的电压依赖敏感性。有研究表明GRIN1通过调节突触的可塑性在记忆和学习中发挥关键作用[18-19]。SLC6A4在中枢系统中的功能涉及将5-羟色胺分子从突触间隙转运回突触前末端以重新利用来调节5-羟色胺能信号转导。SLC6A4的遗传变异会影响精神疾病的一系列症状特征[20]。COMT是一种参与多巴胺降解的酶，CMOT表达或活动异常可能导致多巴胺能功能障碍，进而可能导致常见的精神疾病症状[21-22]。COMT基因的变异，特别是Val158Met多态性，已经被广泛地研究与抑郁症的临床表型和神经认知过程的关系[23]。MAOA分解代谢单胺递质、血清素、去甲肾上腺素和多巴胺，在神经精神疾病的发病、进展和治疗中发挥重要作用。在抑郁症中，MAOA表达的增加和脑内血清素以及去甲肾上腺素水平降低被认为是主要的致病因素。MAOA基因和血清素信号通路基因的功能多态性与抑郁症相关[24]。Akt1属于3种Akt激酶之一，可以调节细胞增殖、存活、代谢、生长和血管生成等许多过程。研究表明，Akt1是一种下游酶，通过调节其下游效应物GSK-3来促进生长因子介导的细胞存活和阻止细胞凋亡，GSK-3具有抗抑郁作用[25-27]。

由阿朴菲类生物碱-靶点-通路网络图可知neuroactive ligand-receptor interaction，serotonergic synapse，cAMP signaling pathway，calcium signaling pathway，dopaminergic synapse为degree值最高的前5条通路。说明这些通路可能是阿朴菲类生物碱治疗抑郁症涉及的主要通路。神经活性配体-受体相互作用信号通路（neuroactive ligand-receptor interaction）是质膜上所有与细胞内外信号通路相关的受体配体的集合，在生理学上与神经功能关系最密切[28]。5-羟色胺能突触（serotonergic synapse）属于神经系统相关通路，与多种精神疾病密切相关如抑郁症、焦虑症、精神分裂等。有研究表明大鼠缺乏5-羟色胺应激时更容易产生抑郁和焦虑症状，并易导致学习、记忆等认知功能受损，对应激适应能力下降[29]。cAMP信号通路又称PKA系统，该通路与抑郁症的发生密切相关。大量研究表明AC-cAMPPKA信号通路在抑郁症患者和动物的海马和皮层中表达下调。钙离子信号通路（calcium signaling pathway）与抑郁症关系密切。长时程增强效应（LTP）被认为是与抑郁症的病因和治疗有关的细胞机制之一。钙与钙调蛋白结合并激活最丰富的神经元激酶α-CaM激酶Ⅱ。CaM激酶自身磷酸化并且还磷酸化AMPA受体，为LTP期间突触末端的电导增加提供分子基础。许多研究将LTP和钙信号与压力、焦虑和抑郁以及抗抑郁作用联系起来[30-31]。多巴胺作为单胺类递质，是下丘脑和垂体的关键神经递质。多巴胺的合成、释放、再摄取或代谢紊乱可导致抑郁症。多巴胺缺乏可以下调多巴胺转运蛋白但上调D2/3受体的浓度。抑郁症患者杏仁核多巴胺转运体减少，多巴胺D2/3受体增加，提示抑郁症可能与大脑多巴胺缺乏有关。因此，多巴胺在抑郁症的病理生理过程中起着重要作用[32]。

本文通过构建阿朴菲类生物碱-靶点-通路网络图，从整体角度分析了阿朴菲类生物碱抗抑郁靶点以及通路，并通过分子对接技术验证了阿朴菲类生物碱化合物与关键靶点的对接结果。综上所述，阿朴菲类生物碱主要通过GRIN1、SLC6A4、COMT、MAOA、Akt1等靶点以及neuroactive ligandreceptor interaction，serotonergic synapse，cAMP signaling pathway，calcium signaling pathway，dopaminergic synapse等通路进行多靶点、通路整合调节，发挥抗抑郁作用。本研究为进一步研究抗抑郁活性成分的实验奠定了理论基础。