卵巢癌类器官模型的研究进展和治疗新策略

孙阜圣 徐冶 张永健 综述 娄阁 审校

卵巢癌是全球女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，严重威胁着女性的生命健康[1-2]。最常见的卵巢癌细胞类型是卵巢癌高级别浆液性腺癌。虽然近年来治疗手段有了不断改进和提升，但卵巢癌治疗后5年生存率仅为20%～40%，死亡率高达80%[3-4]。卵巢癌早期症状不明显，75%的患者发现即是Ⅲ期或Ⅳ期[5]。70%～80%的患者出现复发，患者化疗耐药性增加[6-7]。而相比较下，乳腺癌5年生存率高达91%，10年生存率高达84%[8-9]，卵巢癌的治疗效果没有想象中令人满意。

随着个体化医疗的推行，临床医生为患者决定属于每个患者独有的个体化的治疗方案，从而降低卵巢癌的死亡率[10-11]，但是每一种治疗方案的选择不一定是这个患者的“最佳选择”。识别能够预测治疗反应的生物标志物和或实验模型已逐步成为临床的优先事项[12-13]。类器官的出现为人类生物学研究提供了新的方法，此类研究正在不断发展进步中。类器官可以被应用到卵巢肿瘤的基因分析和药物筛选等各方面研究，为卵巢癌临床前研究提供了一个新的平台。

1 类器官模型临床试验研究进展

类器官是指在体外三维(3D)环境中生长的细胞，形成微型细胞簇，自我组织并分化为功能细胞类型团，包含了体内器官的结构和功能。类器官可以从胚胎干细胞、诱导多功能干细胞、新生儿或成体干细胞中获得，其过程类似于器官获得其独特组织的方式[14-15]。在过去2～3年对于卵巢癌类器官的不断研究中，我们不难发现卵巢高级别浆液性腺癌类器官能够在固定的时间内持续精准地复制肿瘤的许多本质特征[4]。在此基础上，我们可以把类器官作为一种临床试验工具，通过类器官实验以指导治疗方法的选择，并在不久的将来改善对卵巢癌患者的管理。类器官可以用于模拟器官发育和疾病，并在基础研究、药物发现和再生医学中被广泛地应用[16-17]。卵巢癌类器官的构建也同样为卵巢癌临床前研究提供了一个新的平台[18]。

2 卵巢癌类器官的相关临床试验研究

2.1 保持肿瘤异质性

类器官模型可以更好地体现原发肿瘤的形态异质性，包括组织学特点和分化变化[19]。之前研究发现从卵巢癌患者中取得的卵巢癌组织、腹水或者转移性卵巢癌的胸水所构成的卵巢癌类器官模型即使在传代几代后仍然能够高度表达原代肿瘤组织的特征[20]。相关报道显示，来自各种类型的卵巢癌类器官模型精确表达了原代肿瘤的组织学特征和肿瘤异质性[21]。有研究表明，在32例卵巢癌病例的56个类器官系的单细胞DNA测序分析中显示，即使在长时间传代后，卵巢癌类器官仍能准确地完成BRAF、KRAS、PTEN、CDKN2A/B、TP53和RB1等基因的突变表达[22]。

2.2 模拟肿瘤缺氧微环境

肿瘤缺氧是肿瘤微环境最重要的特点之一。缺氧可以促进化疗耐药和降低靶向药物的有效性，已经公认为肿瘤治疗的新靶标。查阅文献所知，我们总结归纳了恶性肿瘤细胞的特征有以下几点，例如肿瘤细胞存在自给自足的生长信号、肿瘤细胞对生长抑制信号的不敏感、肿瘤细胞抵抗细胞死亡、肿瘤细胞基因组不稳定和突变等特点[23]。其中，基因组的不稳定会产生肿瘤的异质性，被认为是不同肿瘤细胞对药物敏感性不同的主要原因[24]。相关实验表明，可以通过构建卵巢高级别浆液性腺癌类器官来验证肿瘤浸润肥大细胞对抗程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)治疗的影响，并通过类器官模型成功模拟肿瘤免疫抑制微环境，以便于预测肿瘤浸润细胞基质增多与免疫抑制性肿瘤微环境相关性[25]。越来越多的科学家通过构建类器官模型，来剖析模拟肿瘤微环境并研究癌症的发展和进展以及疾病治疗中的应用[26]。

2.3 模仿肿瘤发生和转移

由于类器官模型能够高度还原原代肿瘤细胞的遗传异质性，我们可以通过卵巢癌类器官模型来模仿肿瘤的发生和转移。相关实验表明，通过从原代患者卵巢癌肿瘤细胞提取形成盘中转移瘤培养物的方式构建肺类器官，从而研究转移的肿瘤细胞的定植和生长，以便确定防止癌细胞定植的有效方法[27]。Hart等[28]通过构建卵巢癌类器官模型来研究卵巢癌早期转移主要步骤并分析其作用机制。Zhang等[29]通过使用基因工程小鼠模型和构建类器官，评估了输卵管上皮和卵巢表面上皮具有相同致癌异常的肿瘤形成特性，进而研究卵巢癌的发生和起源。

2.4 药物筛选和精准医学

相较于传统细胞系的药物筛选，由于肿瘤细胞在传代过程中的突变较多，使得药物实验筛选的失败率明显升高。而正因为类器官的遗传异质性，它能精确地表达完整的基因序列。近年来，患者来源的肿瘤类器官在药物测试方面具有良好的应用，在抗癌药物的高通量筛选方面具有巨大潜力[30]。McCorkle等[31]通过建立紫杉醇耐药型细胞系和卵巢癌类器官模型，证明了拉帕替尼和波齐替尼对紫杉醇诱导的ABCB1转运蛋白活性的直接抑制的理论。拉帕替尼和波齐替尼联合紫杉醇在体外协同抑制过表达ABCB1的卵巢癌细胞增殖。将美国食品药品监督管理局(FDA)批准的拉帕替尼添加到二线紫杉醇治疗中是治疗复发性卵巢癌患者的一种有前景的策略。Gorski等[32]研究发现，在初次或间歇性减瘤手术时从患者身上开发的患者来源的肿瘤类器官可用于预测临床铂敏感性状态或研究卡铂耐药的驱动因素。Wan等[33]通过构建独特的双特异性PD-1/程序性死亡配体1(PD-L1)处理新型卵巢癌类器官模型并对其培养物进行免疫功能和单细胞RNA测序转录分析。他们通过比较药物在所有免疫细胞中的功能，确定可用的单特异性疗法无法实现的关键性免疫检查点阻断目标，并利用双特异性抗体在T细胞和NK细胞中诱导细胞状态的变化，成功地发现在用免疫疗法治疗的卵巢癌过程中，NK细胞和小部分CD8+T细胞可以通过进入活性和细胞毒性状态来增强治疗效果。类器官模型为今后的治疗药物的筛选及个体化治疗方案的确定提供新的方向。

2.5 基因编辑系统和模拟疾病

由于卵巢癌类器官模型可以精准地表达肿瘤的基因属性，我们可以通过构建卵巢癌类器官来进行预测肿瘤耐药性的相关研究。Hill等[34]通过构建类器官模型，对其中的DNA进行功能分析，测试了来自22例卵巢高级别浆液性腺癌患者的33种类器官培养物的同源重组(HR)和复制叉保护缺陷。研究发现无论DNA修复基因突变状态如何，类器官同源重组的功能缺陷与PARP抑制剂敏感性相关；复制叉保护的功能缺陷与卡铂、CHK1和ATR抑制剂敏感性相关。基因组分析和类器官功能测试的结合可识别靶向的DNA损伤修复缺陷。Zhang等[35]通过慢性病毒基因传导CRISPR/Cas9诱变对小鼠输卵管上皮细胞进行工程改造，生成了多个卵巢癌类器官模型，通过模型进行突变组合，并利用卵巢癌类器官揭示了肿瘤细胞体外增殖分化、基因拷贝数畸变以及致瘤性的差异。由于卵巢癌类器官模型显示出的高度基因相似性，研究者们可通过对类器官产生的趋化因子和细胞因子进行调节，利用药物敏感性和DNA修复之间的缺陷关系，指导药物测试和筛选，促进卵巢癌临床化疗或免疫治疗方案的开发[36]。

3 卵巢癌类器官样本库的建立

卵巢癌类器官模型生物标本库是不同的亚型和等级的卵巢癌癌症类器官，它既可以冷冻保存，又能够在体外快速获得，且具有高成本效益和良好的增殖能力的组织模型。迄今为止，妇科肿瘤学研究者们在卵巢癌类器官生物库的构建方面付出了巨大的努力。Hoffmann等[37]的研究在 Wnt低表达的条件下成功地从13～45例患者中产生了15条类器官(效率约为30%)，用于长期传代培养。冷冻保存超过5个月，每10～20天对卵巢癌类器官进行传代。研究表明即使经过多次解冻和冷冻循环后，类器官也不会发生形态学或增殖能力的显著变化。因此卵巢癌类器官适用于构建生物库，用于探索个体治疗耐药性和药物敏感性，并可朝着为患者量身定制的卵巢癌治疗方向发展。

4 类器官的局限性

尽管在类器官方面取得了创新，但这种创新技术仍然存在一些缺点。首先，大多数类器官仅由上皮层组成，没有包含间充质、神经系统、肌肉层和免疫细胞的生理微环境[38]。尽管目前的类器官技术仍然不允许对生化和生物物理因素进行实时时空控制，但共培养系统可以通过加入额外的微生物和细胞元素来部分复制内部肿瘤微环境[39]。例如，在最近对诱导多功能干细胞衍生的组织工程的研究中，科学家们成功地在类器官培养中开发了一种功能性肠神经系统，证明了创建更复杂的类器官的共培养结构的潜力[40]。其次，为了在体外真实地模拟人体器官的复杂性，研究人员认为类器官培养系统应包括生物材料(如水凝胶)以模拟细胞外基质中的生物力学和生化特性[6]。例如，研究了胶原-纳米纤维素(COL-NC)水凝胶作为具有协同生物活性作用的热响应基质，以支持类器官的起始和生长。与传统基质如人工基底膜基质相比，水凝胶是可以为卵巢癌类器官提供经济的、可持续的和高性能的热响应基质。再次，目前不同研究人员之间对类器官的组成和培养过程差异很大，这种差异引起对结果一致性的怀疑。在卵巢癌类器官构建中，Hoffmann等[37]在Wnt低表达的条件下开发了用于长期体外的卵巢癌类器官生长方式。而另一个研究小组报告了另一种共识，涉及神经调节蛋白1(NRG1)的附加成分，这种神经调节蛋白对卵巢癌类器官形成效率和通过能力具有有益影响。对于基于卵巢癌类器官结论的可扩展性和准确性，未来的尝试也应放在专家共识的标准实验分析上。最后，考虑到特定的培养基包括细胞外基质(例如人工基底膜基质)和补充因子(例如生长因子和激素)，与单层细胞培养物相比类器官的成本更高，这可能会限制它们的应用[41]。

5 3D生物打印技术在类器官模型中的应用

我们可以通过3D生物打印技术中的组织成像、组织构建设计以及喷墨、微挤压或激光生物打印等技术开发复杂的类器官模型[42]。通过将原代细胞输送到大分子和生物材料中的方法，科学家们可以开发出适合移植的3D生物打印类器官模型[43]。研究人员使用微孔水凝胶支架的3D生物打印将功能性生物假体卵巢构建到无菌小鼠体内，其中卵泡种子支架变得高度血管化，当植入手术绝育的小鼠体内时，生物假体卵巢中的生殖功能得以保留。这些发现表明3D生物打印支架孔结构是类器官功能组织工程制造支架设计中的关键变量。90°支架的类器官起到了开放孔隙率，并限制了毛囊-支架相互作用[44]。此外，另一个研究小组在卵巢癌细胞和正常成纤维细胞的3D共培养模型上开发了一种高通量细胞打印系统，该模型通过3D生物打印技术在人工基底膜基质上微图案化。在微环境(细胞间距离和细胞密度)内以高通量方式，卵巢癌细胞在打印过程中保持活力并增殖，这可以实现已建立的类器官模型的小型化，并为高通量提供通过3D生物打印进行卵巢癌药物筛选的工具[45]。

6 小结和展望

在精准医疗逐渐深入人心的今天，随着个体化治疗方案的推行，类器官模型逐渐进入科研工作者们的视野之中，相较于细胞系模型和体外异体细胞移植模型，类器官模型具有高度保持的肿瘤异质性、模拟肿瘤缺氧微环境、模拟肿瘤的发生转移、药物筛选和精准医学、基因编辑系统和模拟疾病等多方面优势。目前，类器官模型还处于发展和改进的阶段，类器官模型还存在很多局限性，将3D生物打印技术和类器官模型相联合可以进一步提高类器官的效用，有望成为今后卵巢癌药物筛选的一项重要工具。在精准医学的要求下，为每一位患者进行个体化治疗，已经成为临床诊疗过程中的必备环节。在不久的将来，类器官模型体可以成为帮助临床诊疗、帮助提供精准治疗“最佳方案”的一项必不可少的科学途径。