间充质干细胞外泌体促进糖尿病皮肤创口愈合的研究进展

赵 云,李秀英，纳 涛，姜金兰*

(1.吉林大学中日联谊医院 科研中心,吉林 长春130033;2.中国食品药品检定研究院，北京102629)

中国糖尿病患病率高达11%以上，糖尿病会导致创口不愈合，糖尿病足等，为糖尿病患者带来巨大的身体和精神创伤[1]。在糖尿病患者中，延迟创口愈合一直是一个主要的问题，约15%的糖尿病患者常常伴有不愈合溃疡的风险[2]，据估计，这些难愈合性糖尿病皮肤创口的患者治疗成本每年约为100亿美元[3]。由此可见，开展促进糖尿病皮肤损伤愈合的相关研究，对提高我国乃至世界的糖尿病患者生存质量、降低致残率有重要意义。

创口愈合通常经历如下阶段：止血、炎症、增殖、收缩和重塑[4-5]。临床及实验研究发现，糖尿病创口的愈合过程与正常创口的愈合过程不同，糖尿病皮肤创口在愈合过程中会停滞在任意阶段，导致创口难以愈合[6]。在糖尿病状态下，由胰岛素绝对或相对缺乏导致糖脂代谢紊乱，创口附近处于高糖、无氧的环境，细胞进行无氧氧化产生乳酸，创口附近pH降低，处于酸性环境，增加了感染的风险，是导致创口慢性长期炎症进而影响愈合的重要因素[7-8]。同时，在糖尿病患者创口愈合的整个阶段，创口长期处于氧化应激状态，同时在慢性炎症及其他因素的作用下，导致创口缺氧、血管新生异常、神经受损且表皮神经数量减少[9]、生长因子分泌减少、细胞外基质成分累积与基质金属蛋白酶重构失衡等问题，是影响糖尿病创口愈合的重要原因。上述因素相互作用及促进，最终导致糖尿病患者创口愈合缓慢甚至不愈合。

临床中治疗糖尿病皮肤创口通过控制血糖、预防创口感染、抗炎，当糖尿病皮肤创口由于感染变得严重时，对患者创口进行及时清创、必要时进行介入甚至截肢等措施。传统的治疗方式对于全身状况较差、病变较严重者的疗效十分有限[10]。在使用抗生素控制感染时，还可能存在抗生素的滥用。近年来，国内外对各种干细胞及其衍生物治疗难愈合性皮肤创口进行了大量的研究，研究表明，多种来源的间充质干细胞(MSC)及其衍生物可用于治疗糖尿病难愈合创口，并且取得了显著的疗效[11]。本文主要对近5年MSC及外泌体(Exo)治疗难愈合性皮肤创口的方式和相关机制展开综述。

1 MSC促进难愈合糖尿病皮肤创口

在本世纪初，首次将MSC应用于治疗糖尿病皮肤创口，取得了优异的治疗效果。通过研究发现，MSC促进糖尿病皮肤创口愈合的机制分为以下3点，①可以分泌多种生长因子，促进皮肤创口处的血管形成[12]、促进胶原沉积[13]。②MSC可以促进机体各种类型的细胞增殖和分化。③MSC可以分泌具有组织修复功能的外泌体。

不同来源的MSC能够不同程度促进糖尿病皮肤创口的愈合。骨髓间充质干细胞[14](BM-MSC)、人脐带血间充质干细胞[15](hMSCs)、脂肪来源的间充质干细胞[16](AD-MSC)均能够促进STZ诱导的糖尿病大鼠模型进行全皮肤层切除的皮肤创口愈合，以上研究均表明，不同来源的 MSC都能有效的促进糖尿病创口的愈合。

目前研究表明，MSC促进糖尿病创口愈合的机制较为复杂，可能涉及多个系统和通路促进糖尿病皮肤创口的愈合，其中MSC可能通过促进血管生成，调节创口处微环境，促进胶原沉积，调节多种因子，最终促进糖尿病皮肤创口的愈合。

1.1 MSC通过分化促进糖尿病皮肤创口愈合具有自我更新和修复能力的MSC是一种多能干细胞，在组织工程学、胚胎工程、细胞工程、基因工程中MSC受到了广泛的应用。MSC被移植到创口后，在一定的条件下，可以促进机体产生各种类型的细胞，如肌成纤维细胞、角化细胞、内皮细胞等参与创口的愈合[17-18]。

1.2 MSC分泌因子促进糖尿病皮肤创口愈合MSC能够产生多种与促进创口愈合相关的因子，如胶原Ⅰ型、血小板衍生生长因子(PDGF)、生长分化因子-11(GDF-11)、血管内皮生长因子(VEGF)、上皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)等。Mona Saheli等[19]发现，成纤维细胞是一种在愈合中起关键作用的细胞。将MSC培养基用于治疗糖尿病创口时，可以使成纤维细胞活力增高，并且bFGF基因表达明显提高，以此促进创口的愈合。Linhao Wang等[20]通过细胞外基质(ECM)包被MSC，增强生长因子VEGF、PDGF、HGF、GDF-11和EGF的表达，能够促进创口的愈合。以上研究证明了MSC能够通过分泌多种因子有效的促进糖尿病创口的愈合。

2 MSC来源的Exo用于治疗糖尿病创口

MSC可以通过直接分泌和旁分泌的方式释放Exo等多种活性物质，激活损伤部位的细胞修复、募集内源性干细胞产生保护或再生机制，改善局部缺氧微环境，还可以通过增加胶原沉积、促进血管生成、减少纤维化和抑制炎症反应等，对组织进行修复[21]。MSC及其衍生物的移植成为治疗难愈合性糖尿病皮肤创口的新希望。因此，MSC及其衍生物通过改善皮肤创口的血供及微环境，达到治疗难治性糖尿病皮肤创口的目的[22-23]。

Exo属于细胞外囊泡(EVs)的一类，其直径大小为30-200 nm[24-27]。Exo是通过胞吐释放到细胞外，并且携带有蛋白质和遗传物质，包括脂类、膜蛋白、核蛋白、核酸，这些物质可以有效地调节长距离或短距离的细胞间通讯，提供了与各种生理和病理过程相关的重要信息[28]。研究表明MSC分泌的Exo具有相当于或大于MSC本身的组织修复能力。更重要的是与细胞移植相比，Exo介导的无细胞治疗提供了更多的安全性，降低了MSC移植导致的异位组织形成的风险和免疫排斥的可能性[29]。Exo有望成为治疗糖尿病难愈合创口更安全有效的方法。

Exo用于糖尿病创口的治疗是一项较为新颖的研究思路，根据Exo的来源和性质，通过与其他材料或者药物协同使用，能够发挥更好的治疗效果。目前的研究中，已经发现不同细胞来源的Exo可以增加血管的生成促进难愈合性糖尿病皮肤创口的修复，Exo还可以通过不同的机制促进糖尿病皮肤创口的愈合。

2.1 促进纤维细胞的生长和迁移Arsalan Shabbir等[30]使用bMSCs来源的Exo治疗糖尿病创口，研究发现bMSCs来源的Exo可以促进糖尿病皮肤创口中成纤维细胞的生长和迁移，促进糖尿病皮肤创口的愈合。Eun Wook Choi等[31]研究表明人脂肪干细胞来源的外泌体(ASC-exo)能刺激人真皮成纤维细胞(HDFS)的再生。在蛋白质水平上，与皮肤再生相关的基因，如CD34、胶原Ⅰ型、弹性蛋白和角质形成细胞生长因子(KGF)的表达升高。在RNA中，ASC-exo含有可抑制NPM1、PDCD4、CCL5和NUP62等基因的miRNA，刺激真皮成纤维细胞的增殖，促进皮肤成纤维细胞的再生。

2.2 促进细胞因子高表达Jinwen Liu等[32]也发现hMSCs来源的Exo含有生成素-2(Ang-2)，作用于糖尿病创口中可以有效的促进创口的愈合。Eun Wook Choi[33]等发现口腔黏膜表现出独特的再生特性，有时被称为胎儿样创口愈合。从人口腔上皮细胞中提取的Exo，可以导致纤维细胞增殖呈剂量依赖性减少，生长因子如HGF、VEGFA、FGF2和CTGF基因表达显著增加。这些指标都显示口腔黏膜上皮细胞来源的Exo可以促进创口的愈合。Mengdie Li等[34]发现巨噬细胞来源的Exo可以抑制创口附近的TNF-α和IL-6的分泌，降低糖尿病创口的炎症反应。

2.3 促进皮肤再上皮化Exos可通过诱导内皮细胞增殖和迁移来加速创口愈合过程，以促进糖尿病创口的血管生成，降低炎症反应，促进血管形成和创口的再上皮化，加速糖尿病创口的愈合。Yin Hu等[15]发现将hMSCs分泌的Exo移植到小鼠的皮肤创口处，可促进再上皮化，减少瘢痕，促进血管生成。值得注意的是miR-21-3p在Exo中被发现高度富集，miR-21-3p是抑制磷酸酶、张力素同系物(PTEN)和发芽同系物1(SPRY1) 的关键介质，是创口愈合的重要调节物质。Chun-Yuan Chen等[35]发现由人尿源性干细胞分泌的外泌体(USC-Exo)，通过富集促进创口愈合的蛋白质，促进创口再上皮化，增加胶原蛋白的沉积，从而有效促进伤口的愈合。

通过以上的研究表明，不同细胞来源的Exo通过不同的机制均可以有效的治疗难愈合性糖尿病创口。

3 Exo联合药物和材料更有效的促进糖尿病皮肤创口的愈合

许多研究表明，除了直接使用Exo外，Exo与不同生物材料、纳米颗粒、药物联合使用，通过控释、物理吸引等方式，有效的提高了Exo治疗糖尿病难愈合创口的治疗效果。

3.1 Exo联合阿托伐他汀(ATV)Muyu Yu等[36]使用阿托伐他汀处理后的bMSCs提取外泌体(ATV-Exos)，在治疗糖尿病皮肤创口时，ATV-Exos促进创口再生的能力优于Exos，同时ATV-Exos和Exos在形态、结构和浓度上没有显著差异。ATV-Exos通过激活AKT/e NOS通路，miR-221-3p显著上调，促进血管的生成，最终有效的促进了糖尿病创口的愈合。

3.2 Exo联合高分子材料高分子材料具有良好的生物相容性，可用于Exo缓释作用。Quan Shi等[1]从牙龈间充质干细胞(GMSCs)中提取的Exo与壳聚糖/丝基水凝胶海绵相混合治疗创口。由于水凝胶可以提供封闭无菌的环境，有效降低了感染的风险。水凝胶的缓释功能，能够有效延长Exo在创口处的保留时间，能够促进糖尿病创口的愈合。Min Wang等[37]制备了一种热敏性、可注射性、自愈性和粘着性的基于多糖的水凝胶支架，具有高效的抗菌活性、快速的止血能力、良好的紫外线屏蔽性能，与Exo相结合(FEP@exo)可以适应糖尿病创口的酸性环境，达到控制释放Exo，可以有效地促进瘢痕组织形成和皮肤附件的愈合。Chenggui Wang等[38]开发了一种可注射、自愈和抗菌的基于多肽的水凝胶,能有效控制Exo的释放，加快血管生成效率，显著提高了糖尿病全厚度皮肤创口的愈合效率。

3.3 Exo联合纳米粒子纳米粒子通过不同的修饰或外源引导具有靶向性，Exo联合纳米粒子可以使Exo更多的聚集在皮肤创口附近，产生更好的治疗效果。Xiuying Li等[39]制备了氧化铁纳米粒子标记的外泌体(ExoNPs)，在尾静脉注射ExoNPs后通过磁铁诱导其积累在创口部位，这些积累在创口处的ExoNPs通过增强内皮细胞的增殖、迁移，促进血管的形成，增加了促细胞增殖因子CK19、PCNA和胶原在体内的表达，促进了糖尿病创口的愈合。该研究通过磁铁吸引Exo所包裹着的纳米颗粒，增加了Exo在体内的趋向性，使其积累在创口部位，显著增强疗效，促进创口的愈合。

4 总结

糖尿病皮肤创口的发病机制极为复杂，创口处微环境长期处于酸性、缺氧、慢性炎症等不利于愈合的因素下，传统治疗手段存在较大的局限性，往往不能达到令人满意的治疗效果。研究表明，MSC作为一种多能细胞，具有强大修复作用，同时Exo作为MSC的一种衍生物，能够促进血管形成、胶原沉积、再上皮化，减少感染、降低炎症反应，改善了糖尿病创口的局部微环境，促进创口的愈合，在治疗糖尿病皮肤创口取得良好的治疗效果，并且通过与各种生物材料、纳米粒子结合能够更好的发挥治疗效果。虽然目前MSC还不能直接用于治疗患者，其中安全性和伦理道德存在较大的争议，但随着MSC作用机制不断明确，Exo提取工艺的不断进步，更好地与各种生物材料、纳米颗粒、药物等相结合，上述问题一定会逐步改善。MSC及其衍生物在临床治疗上的前景将非常广阔，这必将给糖尿病难愈合皮肤创口的患者带来更有效的治疗方式。