一碳代谢酶MTHFD2在肿瘤中的研究进展

施洋峰 应可净 王利民

代谢重编程是肿瘤的一个关键特征，它满足了肿瘤细胞异常增殖时对营养物质的需求，在肿瘤生长、侵袭、转移及化疗抵抗等过程中起到重要作用。其中一碳代谢的改变在肿瘤中尤为明显，研究显示其参与了肿瘤细胞中生物大分子（核酸、氨基酸和脂质等）的合成、同型半胱氨酸甲基化、ATP的合成及氧化还原稳态的维持等[1]。目前靶向一碳代谢酶如二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase,DHFR）和胸苷酸合成酶（thymidylate synthase,TYMS）的药物如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和培美曲塞等已应用于临床，并取得了一定的疗效。然而此类药物由于同时杀伤肿瘤细胞和正常细胞，且靶点特异性低，会引起胃肠道反应、骨髓抑制、肝脏及心脏毒性等不良反应[2]。因此，需要深入探索一碳代谢，寻找更有效的靶点。一碳代谢分为细胞质途径和线粒体途径，其中参与线粒体途径的亚甲基四氢叶酸脱氢酶2（methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2,MTHFD2）在肿瘤中表达明显上调，而在大部分正常成人组织中不表达[3]。最近研究发现MTHFD2与肿瘤的多种恶性表型相关，且具有非代谢的兼职功能（moon‐lighting），同时MTHFD2抑制剂相关研究亦取得不断突破，这提示MTHFD2将成为肿瘤一碳代谢的重要靶点。本文就MTHFD2在肿瘤中的相关研究进展作一综述。

1 MTHFD2在肿瘤中的表达及临床意义

一碳代谢酶MTHFD在细胞内主要包括MTHFD1和MTHFD2。MTHFD1主要位于细胞质，呈广泛表达；而MTHFD2主要位于线粒体，在成人组织中却表达缺失[3]。MTHFD2（37 kDa）由 350个氨基酸构成，2 号染色体核基因MTHFD2编码，是一个NAD(P)依赖的双功能酶，具有脱氢酶活性和环水解酶活性[4]。MTHFD2能将CH2-四氢叶酸（CH2-tetrahydrofolic acid,CH2-THF）催化成10CHO-THF，同时将氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NAD（P）+]转换为NAD(P)H，促进一碳代谢反应[5]。

在胚胎发育过程中MTHFD2通过酶促反应支持细胞的快速增殖，随着组织细胞的成熟逐渐被MTHFD2L替代[6]。在肿瘤中MTHFD2被再度激活，成为表达上调最为一致的一碳代谢酶[3]。MTHFD2在肝癌、肾癌、胰腺癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌和卵巢癌等多种肿瘤中呈过表达现象，与患者不良预后相关[7-13]。胰腺癌患者中，高表达MTHFD2预示患者伴有更短的总生存期（overall survival,OS）和无病生存期（disease-free sur‐vival,DFS）。此外，多因素Cox风险比例回归模型将MTHFD2表达水平确定为OS和DFS的独立预测因子[9]。乳腺癌和肾癌患者中MTHFD2表达上调，并与患者临床分期、病理分级和不良预后相关[8,12]。肝癌患者中MTHFD2表达升高，并且表达量与TNM分期、肿瘤微栓发生率、肿瘤转移、复发率和复发时间呈正相关[7]。在肺腺癌患者中，MTHFD2高表达与男性、吸烟史、进展的临床分期和短OS具有一定关系[10]。因此，MTHFD2与肿瘤的进展有着密切联系，是一个潜在的肿瘤诊疗靶点。

2 MTHFD2对肿瘤表型及代谢的影响

MTHFD2的基本功能是通过脱氢酶活性和环水解酶活性促进一碳代谢循环。当前研究显示，MTHFD2可影响肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、干细胞特性、化疗抵抗及免疫逃逸等表型。Lehtinen等[14]报道转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）可诱导乳腺癌中MTHFD2的表达，敲低MTHFD2会抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力，并降低波形蛋白和CD44的表达。Shi等[10]研究描述了敲低MTHFD2会抑制肺腺癌细胞的增殖和迁移能力，诱导细胞凋亡，逆转上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）。MTHFD2是肿瘤细胞内重要的抗氧化因子。Ju等[11]发现抑制MTHFD2会降低结直肠癌细胞中NADPH/NADP+和GSH/GSSG比值，破坏细胞的氧化还原稳态。应激环境（低氧、侵入血管）会明显升高细胞内的活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平，诱导细胞凋亡，抑制结直肠癌的生长和转移。MTHFD2介导的一碳代谢与肿瘤的发生、发展有着密切联系。Bonagas等[15]研究MTHFD2抑制剂时发现，抑制MTHFD2会引起急性髓系白血病细胞周期S期停滞和细胞凋亡。体内和体外实验表明，MTHFD2抑制剂会阻止一碳代谢循环时胸腺嘧啶的产生，导致DNA复制时尿嘧啶的错误掺入，引起肿瘤细胞的复制应激。Green等[16]在肾癌中的研究表明，MTHFD2可通过一碳代谢产生S-腺苷蛋氨酸（S-Adenosyl methionine,SAM），增加低氧诱导因子-2α（hypoxia inducible factor-2α,HIF-2α）mRNA的甲基化并增强其翻译，进而促进肾癌中MTHFD2的表达及有氧糖酵解。该研究建立了MTHFD2与N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）甲基化之间的联系。在吉非替尼耐药肺癌细胞模型中，敲除MTHFD2会引起嘌呤合成代谢障碍，嘌呤中间体5-氨基咪唑羧基酰胺核糖核苷酸（aminoimidazole carboxamide ribonucleotide,AICAR）积累，肺癌细胞生长受阻[17]。同时，敲除MTHFD2可明显损害肺癌的干细胞特性和吉非替尼耐药性，并起到杀伤肿瘤细胞和预防肿瘤复发的作用。在肿瘤代谢与免疫逃逸方面，Shang等[18]发现MTHFD2驱动的一碳代谢维持了肿瘤细胞内高水平的尿苷相关代谢产物[如二磷酸尿核苷（uridine diphosphate,UDP）-GlcNAc]，促使cMYC的O-GlcNAcylation糖基化修饰，从而提高了cMYC的稳定性，促进了细胞程序性死亡-配体1（programmed cell death-ligand 1,PD-L1）的转录。由此可见MTHFD2介导的一碳代谢影响着肿瘤的恶性表型，促进了肿瘤的发展。

3 MTHFD2的兼职功能

除了一碳代谢酶活性外，MTHFD2还表现出非代谢的兼职功能。目前的研究结果显示执行兼职功能的MTHFD2主要定位于细胞核[5]。Gustafsson等[19]的研究证实在细胞核的DNA复制位点存在MTHFD2，且过表达无酶促活性的MTHFD2同样会促进肿瘤细胞的增殖。在小鼠胚胎干细胞中，细胞核内的MTHFD2可通过稳定核酸外切酶1（exonuclease 1,EXO1）的磷酸化促进DNA同源重组修复，维持多能干细胞特性[20]。MTHFD2半衰期明显短于其他代谢酶，提示其具有调节细胞信号的可能。Koufaris等[21]利用免疫共沉淀及质谱技术发现MTHFD2能与一系列核蛋白结合，参与调节RNA的代谢和翻译，促进肿瘤细胞的增殖。其中的核蛋白包括小核糖体亚单位和参与RNA加工的不均一性核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleo‐protein,hnRNP）蛋白家族。Liu等[22]的研究同样表明细胞核内的MTHFD2可以发挥兼职功能促进膀胱癌生长。机制研究显示MTHFD2能与细胞周期蛋白依赖激酶 2（cyclin-dependent kinase 2,CDK2）结合，激活CDK2以磷酸化Rb，进而释放转录因子E2F1，促进细胞周期进程。此外，MTHFD2还参与调节STAT3和AKT/GSK-3β/β-catenin 信号通路[10,23]。而 MTHFD2具体是如何直接调节这些信号通路有待进一步探索。深入解锁MTHFD2的兼职功能有助于更好地理解其作用机制。

4 表达调控机制

肿瘤中MTHFD2表达普遍上调，目前表达调控相关研究主要集中在细胞外刺激、转录及转录后水平。在生长因子的刺激下，肿瘤细胞哺乳动物雷帕霉素复合物1（mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1）信号活化，激活了转录激活因子4（activating transcrip‐tion factor 4,ATF4），随后ATF4结合启动子区转录上调MTHFD2的表达[24]。转录因子Nrf2可转录调控MTHFD2的表达，促进NADPH的生成，增加肿瘤细胞的抗氧化应激能力[25]。在肾癌中，MTHFD2代谢产生的SAM可以通过m6A甲基化修饰增加HIF-2α的翻译；而HIF-2α则可以促进MTHFD2的转录，两者构成正反馈环[16]。在Ewing肉瘤中，原癌基因驱动因子EWS-FLI1作为嵌合转录因子能正向调节MTHFD2的表达，影响细胞中丝氨酸-甘氨酸的生物合成和氧化还原稳态[26]。MYC是细胞周期、凋亡、代谢及基因组不稳定性的重要调节因子，激活MYC信号能显著促进肿瘤细胞增殖。Pikman等[27]在急性髓系白血病细胞中证明了MYC可以结合MTHFD2的启动子区。同时，结直肠癌中Kras相关通路如PI3K/AKT通路和RAF/MEK/ERK通路，可通过c-Myc转录上调MTHFD2的表达[11]。在肺癌中亦有相似的研究结果[28]，Kras突变的非小细胞肺癌也是通过MYC上调MTHFD2的表达，从而增强肿瘤细胞的一碳代谢。另外，不少抑癌因子可以负向调控MTHFD2的表达。SOX7是一个具有抑癌作用的转录因子。在乳腺癌中，SOX7可以抑制MTHFD2转录从而抑制乳腺癌的进展[29]。抑癌基因p53可以转录抑制MTHFD2[30]。在p53缺陷的肿瘤中，MTHFD2表达上调尤为明显，并且可以通过非同源末端连接（nonhomologous end joining,NHEJ）来修复DNA损伤，促进细胞增殖。miRNA是基因转录后水平的重要调控因子。在肿瘤中，miR-9[31]、miR-22[32]、miR-940[33]、miR-33a-5p[34]、miR-92a[35]、miR-504-3p[36]和 miR-30a-3p[10]可以与mRNA的3'非翻译区（3'untranslated region,3'UTR）结合，抑制MTHFD2的表达。而上述抑癌因子在肿瘤中多呈低表达现象。因此，靶向MTHFD2的调节因子将成为抑制MTHFD2的另一策略。

5 MTHFD2抑制剂的研发

由于MTHFD2在肿瘤中的选择性表达及其临床相关性，不少研究开始着手MTHFD2抑制剂的研发。天然产物carolacton最初被认为是一种抗菌化合物，有研究显示其在低nM浓度范围可靶向FolD/MTHFD抑制一碳代谢，在mM浓度下可抑制肿瘤细胞的生长[37]。然而carolacton尚缺乏对MTHFD2的选择性。小分子抑制剂LY345899是一种叶酸类似物，能够抑制结直肠癌人源肿瘤异种移植（patient-derived tumor xenograft,PDX）小鼠中肿瘤的生长。但LY345899可同时抑制MTHFD2（IC50：663 nM）和 MTHFD1（IC50：96 nM），对MTHFD2 的特异性并不强[11]。2019 年，Kawai等[38]报道了一种基于三环香豆素支架的化合物DS44960156，其对MTHFD2的选择性明显高于MTHFD1（＞18倍），但效力较低（MTHFD2的IC50：1.6 μM）。同年，Kawai等[39]对DS44960156进行优化后，展示了另一化合物DS18561882。相比于MTHFD1（IC50：0.57 μM），DS18561882对MTHFD2（IC50：6.3nM）具有更高的效力和选择性。此外，DS18561882还具有良好的口服药代动力学特征（GI50：140 nM），是第一个被报道的口服MTHFD2抑制剂。最近，Bonagas等[15]提出了 3种 MTHFD2抑制剂（TH7299、TH9028和TH9619），而相关特异性及安全性有待进一步优化及验证。

6 小结与展望

肿瘤的发生、发展伴随着一碳代谢的重塑，其中线粒体途径的代谢通量上升尤为明显。一碳代谢酶MTHFD2选择性地在肿瘤中表达上调，且与多种临床参数相关，提示着其在肿瘤诊疗中的潜在价值。MTHFD2不仅通过代谢酶活性影响了肿瘤增殖、转移、干细胞特性、化疗抵抗及免疫逃逸等恶性表型，还具有非代谢的兼职功能促进肿瘤的生长，因此抑制MTHFD2将有效阻止肿瘤进展。肿瘤中原癌基因及抑癌基因的表达失调共同促进了MTHFD2的上调，而MTHFD2本身亦可影响这些调节因子的含量。由此可见，靶向相关调节因子亦将起到抑癌作用。目前已提出了多种MTHFD2抑制剂，但其在不同肿瘤中的疗效及不良反应有待进一步评估。此外，相关抑制剂目前尚缺乏临床前及临床研究的验证。今后的研究将深入探索MTHFD2在不同肿瘤中的代谢及非代谢功能，加快MTHFD2抑制剂的临床转化，为肿瘤的治疗提供新的策略。