松材线虫性别决定基因Bx-sex-1表达特征和生物学功能分析

韦鹏飞，理永霞*，冯宇倩，刘振凯，张星耀

(1.南京林业大学，南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；2.中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所，国家林业和草原局森林保护学重点实验室，北京 100091)

松材线虫病是由松材线虫侵染引起的一种毁灭性松林病害。20世纪初于日本长崎市首次发现，随后迅速蔓延至亚洲多个国家和地区[1-2]。1982年在南京首次发现，2021年底已扩散至我国19个省(自治区、直辖市)728个县级行政区，引起松树的大面积枯萎死亡[3-4]。松材线虫侵染松树后，可在短时间导致松树枯萎死亡。松材线虫的致病性与其繁殖能力密切相关[4]。松材线虫作为雌雄异体的生物，雄性和雌性都有一个管状性腺，从泄殖腔(雄性)或阴门(雌性)(近端区域)向前面(远端区域)延伸[5]，单倍体精子使单倍体卵母细胞受精，两个原核重新排列，一起移动，融合并开始二倍体发育[6]。两性的交配繁殖是松材线虫种群繁殖扩张的唯一途径，雄性松材线虫通常被处女的雌性所吸引，但不会被L4龄期、产卵的雌性或交配过的雌性所吸引。雄性和雌性相互吸引似乎是挥发性或水溶性的化合物作用的[7]，对松材线虫蛔甙生物合成过氧化物β氧化途径下游基因Bx-daf-22进行RNA干扰(RNAi)：沉默后的功能分析间接证明了中长链蛔甙可能是引起松材线虫雌性对雄性产生吸引的主要物质[8]。

在许多生物中，性别是由染色体计数机制决定的，该机制将一个性染色体与两个性染色体区分开。在果蝇(Drosophilamelanogaster)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中，XX胚胎发育为雌性(或雌雄同体)，而XO或XY胚胎发育为雄性[9-10]。直到最近，分子遗传学方法明确了这种X∶A性别决定信号的组成部分，一组称为X信号元件(XSEs)的X染色体连锁基因传递X染色体剂量，一组称为常染色体信号元件(ASEs)的常染色体连锁基因传递倍性[11]。XSE的活性归因于4种基因的突变和X上的2-MU区间定义的染色体复制和缺陷：SEX-1(一种核激素受体)、CEH-39(一种同源结构域蛋白)、SEX-2和1 XSE区域协同作用，在转录水平上控制xol-1(编码小分子代谢激酶)。研究表明sex-1基因对X染色体计数是至关重要的，改变XX或XO胚胎中的性别sex-1基因剂量会导致性别转化和剂量补偿不足而死亡[12]。Gladden等[11]则更深入地探讨了XSEs传递X染色体计量的机制，确定了单个XSE对X∶A信号的相对贡献，发现从大到小依次为sex-1 > sex-2 > fox-1(一种RNA结合蛋白)> ceh-39(使DNA结合活性)≥ 1 XSE[11]。

关于松材线虫性别决定基因的研究,Zhou等[13]对松材线虫mab-3基因进行干扰，发现雄虫的体积和精子大小明显小于对照组，有26.3%的雄性无法产生精子，然而，敲除Bxy-mab-3并不能像其他动物一样改变性别比例。对tra-1的研究结果表明，tra-1基因影响雌虫卵巢、阴门和雄虫精巢、交合刺的发育，同时亲本和后代的性别比降低[14]。松材线虫的单倍体数(n)为6(2n= 12)，并且所有的染色体看起来相似，没有明显的性染色体，性别决定系统可能由XX雌性和XY雄性组成[5]。线虫的性别决定基因序列进化得非常快，sex-1基因是否在松材线虫的性别决定中起作用，迄今鲜见相关报道，对sex-1基因的研究可以进一步了解松材线虫的性别决定系统。

1 材料与方法

1.1 松材线虫虫株及培养条件

研究所用的松材线虫来自中国林业科学研究院松材线虫实验室保存的Nxy61虫株，该虫株分离于2012年10月浙江宁波当年发病的马尾松，于25 ℃培养箱中黑暗培养。

1.2 松材线虫总RNA的提取和cDNA的合成

将松材线虫接种于生长7 d左右的灰葡萄孢，25 ℃下黑暗培养7 d左右，用贝尔曼漏斗法收集线虫。将收集的线虫用ddH2O冲洗3次，用质量分数0.5%的硫酸链霉素溶液处理30 min，再次用ddH2O冲洗3次，10 000 r/min离心3 min后，用移液枪去除上清液，用液氮迅速冷冻处理，保存于-80 ℃。用RNA提取试剂盒RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN，Germany)提取松材线虫总RNA。以松材线虫总RNA为模板，通过cDNA第1链合成试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，Japan)反转录合成cDNA模板。

1.3 Bx-sex-1基因的cDNA克隆和系统发育分析

根据秀丽隐杆线虫的Ce-sex-1蛋白序列在WormBase中松材线虫全基因组(whole-genome shortgun)进行BLAST比对，下载相应的CDS序列。然后根据CDS序列使用Primer 6.0设计引物，并由华大基因合成Bx-sex-1-5和Bx-sex-1-3，分别扩增5′和3′端。PCR产物的克隆转化按照pEASY-Blunt Simple Cloning Kit(北京全式金生物技术有限公司)进行，菌液由北京六合华大基因科技有限公司测序完成。

利用Clustal-W对Bx-sex-1和其他物种的氨基酸序列进行比对，基于分子进化遗传分析(Mega 6)中的Jones-Taylor-Thornton(JTT)模型，采用邻接法(neighbor joining，NJ)方法进行系统发育构建。

1.4 松材线虫不同发育阶段Bx-sex-1的相对表达量

松材线虫卵(egg)的收集按照Iwahori描述方法进行[15]，25 ℃黑暗孵化1 d后得到2龄幼虫(L2)。将收集的2龄幼虫接种于灰葡萄孢，分别培养36、54和76 h[16]，收集3龄幼虫(L3)、4龄幼虫(L4)和成虫(adult)。不同发育阶段的相对表达量采用荧光定量PCR法，荧光定量PCR按照TB GreenTMPremix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)说明和仪器设置(Light Cycler 480 System)进行，引物为q-Bx-sex-1。使用4步法扩增反应：①变性，变性 95 ℃ 30 s，1次循环；②扩增反应，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40次循环；③溶解曲线，95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min；④降温，50 ℃ 30 s。

以松材线虫β-actin为内参基因，采用2△△Ct法分析计算松材线虫Bx-sex-1基因的相对表达，每个样品为3个生物学重复，3个技术重复。

1.5 qRT-PCR法检测雌雄虫Bx-sex-1拷贝数

松材线虫雌雄虫基因组Bx-sex-1拷贝数的检测采用qRT-PCR法[17]。

根据线虫形态，分别挑选雌雄虫。DNA的提取方法参照TIANamp Genomic DNA Kit[天根生化科技(北京)有限公司]的说明进行。DNA的提取过程加入4 μL RNaseA(100 mg/mL)溶液(天根RT405-12)，去除RNA。

内参基因的选择为单拷贝基因Bx-daf-12[18]。根据松材线虫参考基因组，分别设计C-Bx-daf-12和C-Bx-sex-1特异性引物(表1)，以松材线虫混合DNA为模板，进行PCR产物扩增、纯化、连接、测序和不同浓度重组质粒的制备。以不同浓度的重组质粒制作标准曲线，以雌雄虫的DNA为模板，进行qRT-PCR，qRT-PCR 的反应体系和条件均参照1.4。

表1 实验所用引物

1.6 松材线虫Bx-sex-1基因dsRNA的合成和RNA干扰

使用Bx-sex-1基因的cDNA全长在NCBI进行比对，根据比对结果，选择特异性高的片段，然后利用Primer 6.0对此特异性高的片段进行引物设计。设计合成两对带有T7启动子的特异性引物，以前文中所述阳性菌液为模板，以Bx-sex-1-T7-F和Bx-sex-1-R合成带T7启动子的F端，Bx-sex-1-T7-R和Bx-sex-1-F合成带T7启动子的R端，试剂为Prime STAR HS(TaKaRa公司，Japan)。按照 T7 RIBOMAX TM Express RNAi System(Promega公司, USA)试剂盒合成dsRNA。

通过浸泡法对松材线虫的Bx-sex-1基因进行RNA干扰。浸泡体系如下：成虫，15头/μL；溶液为1×M9缓冲液；dsRNA溶液质量浓度2 mg/mL。浸泡条件：25 ℃黑暗条件下150 r/min，震荡培养36 h。对照组不含dsRNA，用1×M9代替，阴性对照为ds-GFP，质量浓度为2 mg/mL。浸泡完成后先用1× M9冲洗3次，除去多余的dsRNA；然后吸取大约1 500头线虫，12 000 r/min条件下离心5 min，液氮迅速冷冻，提取RNA用于后续qRT-PCR检测RNAi效果，检测引物为q-Bx-sex-1，内参基因参考β-actin。接种1 500头成虫于灰葡萄孢，1 d后收集产生的卵，统计孵化率，同时将孵化的2龄幼虫接种于灰葡萄孢培养3 d，统计成虫时的雌雄比。

2 结果与分析

2.1 松材线虫Bx-sex-1基因的cDNA全长克隆和系统发育分析

松材线虫Bx-sex-1(从ATG到TGA)全长3 566 bp，包含8个外显子和7个内含子。测序结果显示其cDNA全长为2 637 bp，编码1个878个氨基酸的蛋白质，Prosite预测大小为96.917KU(https://prosite.expasy.org/)。使用DNAMAN与WormBase的BXY_0906300进行比对，序列完全一致。系统进化分析表明松材线虫Bx-sex-1和其他两个植物寄生线虫作为植物寄生线虫被聚为一支，与自由生线虫和寄生动物线虫被划分为不同的分支(图1)。

2.2 松材线虫Bx-sex-1基因不同发育阶段的表达

采用qRT-PCR分析了Bx-sex-1基因在松材线虫卵(egg)、2龄幼虫(L2)、3龄幼虫(L3)、4龄幼虫(L4)和成虫(adult)中的相对表达量。Bx-sex-1在卵中相对表达量最高，在2龄幼虫时期最低，从2龄幼虫时期到成虫时期相对表达量逐渐升高(图2)。

2.3 松材线虫雌雄虫基因组Bx-sex-1基因的拷贝数分析

利用qRT-PCR分析Bx-sex-1基因在雌虫和雄虫的拷贝数，由结果(表2)可以看出，样本雌虫1和雌虫2的Bx-daf-12拷贝数与Bx-sex-1拷贝数之比值分别为1.24和1.30；样本雄虫1和雄虫2的该拷贝数之比为1.26和1.31，说明Bx-sex-1在雌雄虫基因组中拷贝数一致，由于Bx-daf-12为单拷贝基因，所以Bx-sex-1在雌虫和雄虫基因组中也分别为单拷贝。

表2 Bx-sex-1基因在雌雄虫基因组的拷贝数分析

2.4 Bx-sex-1基因RNAi对卵的孵化率和雌雄比的影响

采用qRT-PCR方法检测对照组、dsGFP组和处理组的Bx-sex-1基因相对表达量。CK和dsGFP组没有差异，而处理组与对照组和dsGFP组相比，有显著性差异(图3)。

RNA干扰处理后，处理组后代卵的孵化率下降，而对照组和GFP卵的孵化率接近100%，说明Bx-sex-1会影响卵的正常发育；同时RNA干扰后，处理组后代的雌雄比降低(图3)。

3 讨 论

松材线虫是松树的一种毁灭性病害，其种群的快速繁殖是导致松树死亡的重要原因[19]，而性别分化对于以雌雄两性为基础的松材线虫种群的繁殖至关重要。本研究采用RNAi的方法，将Bx-sex-1干扰后，测定了松材线虫后代卵的孵化率、成虫时的雌雄比，结果显示RNAi后，卵的孵化率降低，雌雄比也同样降低。

线虫的性别决定基因序列进化非常快[20]。已知只有两种秀丽隐杆线虫基因与在多种动物中具有性别特异性作用的基因有关：mab-3和mab-23，并与果蝇基因double-sex和一些脊椎动物基因(也具有性别特异性)一起属于DM域转录因子家族。使用DNAMAN对松材线虫Bx-sex-1和其他线虫氨基酸序列进行比对，分析表明松材线虫与其他线虫氨基酸的序列一致性较低，为28.92%，表明Bx-sex-1基因序列进化非常迅速。系统进化树显示松材线虫Bx-sex-1和其他两个植物寄生线虫聚为一支，与自由生线虫和寄生动物线虫分别进化为不同的分支。Bx-sex-1在不同发育阶段的表达模式与秀丽隐杆线虫相似，而在卵期表达量最高，说明Bx-sex-1在卵的发育过程中可能起着重要作用。同时，从2龄幼虫时期到成虫时期，Bx-sex-1表达量逐渐升高，可能是参与了线虫发育的其他过程，在秀丽隐杆线虫中，sex-1在前远端尖细胞、肠道细胞、卵母细胞和后远端尖细胞中进行表达[21,12]。秀丽隐杆线虫Ce-sex-1基因为伴X染色体，然而在松材线虫雌雄虫基因组中，Bx-sex-1均为单拷贝，这可能与松材线虫染色体分化有关，在松材线虫雌虫和雄虫染色体中，所有的染色体形态都非常相似，并未发现明显的性染色体[5]。

Sex-1基因不同位点的突变可导致后代30%左右的卵死亡和发育停止[22-24]。笔者的研究结果显示，同CK和dsGFP组相比，RNAi后，卵的孵化率显著下降，但是低于秀丽隐杆线虫后代30%的死亡率，可能是RNAi效率并不如突变体彻底；或者是RNA干扰效率不高的原因，研究表明RNA干扰效率在双桅隐杆线虫和腐生水果线虫中比秀丽隐杆线虫要低[25-26]。RNAi后，后代的雌雄比降低，这可能是RNAi后，雌性的死亡率高于雄性的所致。在秀丽隐杆线虫中，sex-1纯合子的雄性的活性降低到89%左右，然而XX纯合子的雌性只有37% 的成活率[12]。

性别决定是线虫研究的一个基础方面，目前关于松材线虫性别决定方面研究很少。松材线虫基因组测序的完成为了解松材线虫性别决定基因进化提供了有利的条件[27]。Sex-1和ceh-39、sex-2、fox-1共同调控染色体剂量补偿效应，本研究初步了解了sex-1在松材线虫发育过程中的作用，但关于sex-1和其他基因的协同作用，还需要更深一步的研究。