喜旱莲子草与乌蔹莓等植物提取物对松材线虫的毒杀活性研究

江 奕，陈凤毛

(南京林业大学，南方现代林业协同创新中心，南京林业大学林学院，江苏 南京 210037)

松材线虫病(pine wilt disease)又称松树萎蔫病，是一种由松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)寄生，宿主为松树，天牛作为传播媒介，伴生细菌和真菌以及人为干涉等外部环境变化引起的松树毁灭性病害[1]。自20世纪80年代在南京中山陵首次发现松材线虫病以来，国内研究者采取了各种措施来防治该病，但危害范围仍不断扩大，现已扩展到华东、东北、华南、西南等多个地区，对我国的松树资源和生态环境构成了巨大威胁[2-3]。目前主要使用药剂进行防治，虽然见效快、效果好，但是用量大、成本高，容易引起环境污染，严重危害生物多样性和生态安全。

随着人们环保意识的不断加强，如何利用自然、绿色的天然产物对线虫进行有效防治备受世界各地研究人员的关注[4-5]。而我国更是早在汉代就有了利用植物进行病虫害防治的记载[6-7]。近年来，国内对植物杀虫剂方向的研究相继开展，文艳华等[8]研究发现毛鱼藤(Paraderriselliptica)、狼牙刺(Sophoradavidii)、粗榧(Cephalotaxussinensis)等植物提取物对松材线虫有强致死性。巨云为等[9-10]研究表明用苦楝(Meliaazedarach)树皮、果实以及万寿菊(Tageteserecta)乙醇粗提取液浸泡线虫可将其杀死。高雯芳等[11]报道沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)提取物不仅杀虫效果显著而且活性更好。焦宏伟等[12]首次发现采用质量浓度为10 g/L的牡丹(Paeoniasuffruticosa)茎皮、黄连(Coptischinensis)和大黄(Ligulariaduciformis)提取液对松材线虫成虫和虫卵具有强致死作用。

植物源化合物为植物次级代谢产物，相比于化学药剂对生态环境影响更小。因此，寻找并合理利用植物源化合物杀死线虫，对线虫病防治具有重要意义[13]。本研究采用浸渍法测定了喜旱莲子草(Alternantheraphiloxeroides)、乌蔹莓(Cayratiajaponica)、迷迭香(Rosmarinusofficinalis)等30 种植物乙醇提取物对松材线虫的毒杀活性，进一步对毒杀活性强的喜旱莲子草、乌蔹莓化学成分进行分离提取，并研究这两种植物萃取物对松材线虫的毒杀活性，为研发植物源杀线剂[14-17]提供实验支撑。

1 材料与方法

1.1 供试植物的采集

于江苏省南京市和云南省昆明市采集供试的30种植物，具体供试部位见表1。采用实验室蒸馏水洗净后，将其放置在阴凉通风处风干粉碎后，过孔径为0.3 mm的筛，遮光储存以备后用。

表1 供试植物名录

1.2 供试线虫液与卵液制备

筛选出特征明显的松材线虫，在25 ℃培养箱中用灰葡萄孢(Botrytiscinerea)培养9～13 d。待灰葡萄孢被完全取食后，用贝尔曼漏斗法分离线虫，再加入无菌水制成活力最佳的线虫液(2 000 条/mL)，4 ℃密封备用。

将产卵雌虫吸入含有蒸馏水的培养皿中产卵，25 min后将雌虫从中吸出，虫卵则留在培养皿上。加入3%(质量分数)过氧化氢对虫卵处理2 min，用无菌水反复清洗线虫卵，并配制成约为2 个/μL的卵粒悬浮液。

1.3 供试植物提取物的制备

称取100 g样品，并将其浸泡在500 mL无水乙醇中，室温放置24 h后过滤，再加入等量无水乙醇浸泡滤渣，反复浸泡过滤3次。通过旋转蒸发仪将合并的滤液经减压浓缩至稠膏状粗提物后停止，再将稠膏状物25 ℃静置30 min，获得植物乙醇提取物备用。

分别取5 g喜旱莲子草和乌蔹莓乙醇提取物，用少量无水乙醇溶解后，加入250 mL蒸馏水加热溶解成悬浮液，转移至分液漏斗，加石油醚连续萃取3次。剩余水层依次用乙酸乙酯和正丁醇分别萃取3次，用旋转蒸发仪减压浓缩回收各有机溶剂，得到相应萃取物。

1.4 30种植物乙醇提取物对松材线虫的毒杀活性测定

在24孔细胞培养板的孔内分别注入100 μL线虫悬浮液，再加入100 μL 100 g/L植物乙醇提取物及800 μL蒸馏水(含体积分数2%丙酮)混匀，杀虫液最终质量浓度为10 g/L。以含2%丙酮的蒸馏水作为空白对照组，重复3次。于25 ℃恒温保湿培养箱中，静置24和48 h，分别测定线虫死亡数，并计算相应的校正死亡率。

校正死亡率=(处理组线虫死亡率-对照组线虫死亡率)/(1-对照组线虫死亡率)×100%。

按照文献[18]方法对杀虫活性强弱进行分级：校正死亡率≤10.0%，杀线活性极弱，用“-”表示；10.0%<校正死亡率≤30.0%，杀线活性弱，用“+”表示；30.0%<校正死亡率≤50.0%，杀线活性中，用“++”表示；50.0%<校正死亡率≤80.0%，杀线活性强，用“+++”表示；校正死亡率>80.0%，杀线活性极强，用“++++”表示。

1.5 喜旱莲子草和乌蔹莓对松材线虫成虫及虫卵的毒杀活性测定

1.5.1 两种植物提取物及其萃取物对松材线虫的毒杀活性测定

分别称取5 g提取物及各萃取物，用蒸馏水(含2%丙酮)溶解，并稀释定容配制成5个浓度梯度的药液。在24孔细胞培养板的孔内注入0.2 mL线虫悬浮液，再加入0.2 mL的药液，用无菌水补齐不足，使得各孔内的液体总体积相等。根据预试验测试的药液有效浓度范围，最终药液的质量浓度梯度为：10.000、5.000、2.500、1.250和0.625 g/L。以含2%丙酮的蒸馏水为对照，设3次重复试验。于25 ℃恒温保湿培养箱中，分别培养24、48和72 h后，测定线虫死亡数，并计算相应的校正死亡率。

1.5.2 两种植物提取物及其萃取物对虫卵的孵化活性测定

在培养板各孔中加入100 μL线虫卵悬液，按1.4所述方法配制浓度，进行3次重复，在25 ℃恒温保湿培养箱内培养，24 h后开始观察，在光学显微镜下观察记录松材线虫虫卵孵化情况，32 h后结束观察，通过镜检统计线虫卵数，并计算相应的线虫卵累计孵化率和孵化抑制率。

线虫卵累计孵化率=孵化线虫总数/线虫总卵数×100%；

虫卵孵化抑制率=(对照组虫卵累计孵化率-处理组虫卵累计孵化率)/对照组虫卵累计孵化率×100%。

1.6 数据处理

用Excel 2016结合DPS 9.01处理和分析数据，得到各处理物浓度与线虫校正死亡率的线性关系方程。

2 结果与分析

2.1 30种植物提取物对松材线虫的毒杀活性

本试验测定了各种供试植物提取物溶液对松材线虫成虫的毒杀活性,并用线虫的校正死亡率来判断供试植物提取物对线虫的毒杀效果。从结果(表2)可以看出，所采集的30种植物的乙醇提取物对松材线虫成虫都有不同程度的毒杀作用,喜旱莲子草和乌蔹莓提取物对松材线虫表现出强毒杀活性，24 h后线虫校正死亡率均达到100%。此外，泽漆(Euphorbiahelioscopia)、辣蓼(Polygonumflaccidum)、紫花地丁(Violaphilippica)和迷迭香的乙醇提取物在处理48 h后，也表现出较强活性，处理线虫校正死亡率分别为54.56%、51.84%、63.47%和72.15%；络石(Trachelospermumjasminoides)、大花旋复花(Inulabritanica)、冬青卫矛(Euonymusjaponicus)等10种提取物的48 h处理线虫校正死亡率为30%～50%；菖蒲(Acoruscalamus)、迎春(Jasminumnudiflorum)、玉簪(Hostaplantaginea)等14种提取物处理线虫校正死亡率仅为10%～30%。

表2 植物提取物对松材线虫的毒杀活性

2.2 两种植物乙醇提取物在不同浓度下对松材线虫的毒杀活性

由不同浓度的植物乙醇提取物对松材线虫的致死情况(表3)可知，处理72 h后，喜旱莲子草和乌蔹莓的乙醇提取物对松材线虫均有毒杀作用，其活性与浓度呈正相关。随着药液浓度的降低，其毒杀活性逐渐减弱，但在最低测试质量浓度0.625 g/L时，两种植物的乙醇提取物对线虫作用后的校正死亡率分别为40.91%和24.62%。说明喜旱莲子草和乌蔹莓的低浓度提取物仍具有一定的杀线活性。

表3 不同浓度的植物乙醇提取物对松材线虫的致死率

2.3 不同极性溶剂萃取物对松材线虫的毒杀活性

对喜旱莲子草和乌蔹莓乙醇提取物进一步分离，分别得到石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层4种萃取物，10 g/L质量浓度对松材线虫的致死活性见图1。说明两种植物萃取物的作用效果与处理时间呈正相关，随着试验时间的延长，各处理的松材线虫死亡率均呈上升趋势。

喜旱莲子草乙酸乙酯萃取物的杀线虫活性最强，其次是石油醚层，水层次之，而正丁醇层对线虫的毒杀活性最弱；而且乙酸乙酯萃取物的作用较稳定，24、48、72 h时校正死亡率均达 100%，其活性强度均保持极强(++++)。

乌蔹莓与喜旱莲子草试验结果区别较大，水层的毒杀活性最强，其次是正丁醇层，乙酸乙酯层次之，石油醚层的活性最弱。且水层萃取物的作用较稳定，但杀线有效物质微溶于正丁醇溶剂，故水层萃取物在24、48、72 h时校正死亡率分别为86.44%、97.15%、100%，其活性强度均保持极强(++++)。

可见，具有杀线虫活性的主要物质分别集中在喜旱莲子草乙酸乙酯萃取物和乌蔹莓水层萃取物中。且通过对比药剂处理时长发现，除喜旱莲子草乙酸乙酯萃取物质量浓度为10 g/L时，其余各组萃取物处理的线虫校正死亡率随着处理时间延长而攀升，说明这两种植物萃取物具有良好的持效性。

2.4 萃取物浓度对松材线虫的毒杀活性影响

喜旱莲子草乙酸乙酯萃取物和乌蔹莓水层萃取物在3个处理时间下对松材线虫的影响结果(表4)可知，两种植物萃取物毒杀活性与其浓度成正比，此外，其作用效果与处理时间呈正相关，随着试验时间的延长，线虫死亡率也随之增加。

表4 不同浓度的两种植物萃取物对松材线虫的毒杀作用

喜旱莲子草乙酸乙酯萃取物对松材线虫表现出极高的毒杀作用。以其浓度含量对数为自变量(x)，校正死亡率概率值为因变量(y)，得到72 h的毒力回归方程y=4.211 8x+5.968 8，相关系数R=0.922 3，半致死浓度(LC50)为0.588 8 g/L，95%置信区间为0.257 2～1.348 2 g/L。

乌蔹莓水层萃取物对松材线虫表现出极高的毒杀作用。以其浓度含量对数为自变量(x)，校正死亡率几率值为因变量(y)，得到72 h的毒力回归方程y=4.786 2x+4.512 2，相关系数R= 0.969 3，半致死浓度(LC50)为1.264 5 g/L，95%置信区间为1.781 0～0.897 8 g/L。

可见，喜旱莲子草乙酸乙酯萃取物和乌蔹莓水层萃取物对于松材线虫具有毒杀效果，并且相比其他植物喜旱莲子草乙酸乙酯萃取物毒杀效果表现更显著。

2.5 萃取物对松材线虫虫卵孵化的抑制作用

由两种植物萃取物对松材线虫虫卵孵化的影响情况(表5)可知，处理32 h后喜旱莲子草乙酸乙酯萃取物和乌蔹莓水层萃取物均可抑制松材线虫卵的孵化，虫卵孵化率增长速度显著降低，孵化抑制率均高于46%，且喜旱莲子草乙酸乙酯萃取物的处理效果最佳，孵化抑制率为79.77%。结合上述两种植物萃取物对松材线虫成虫的试验结果表明，喜旱莲子草和乌蔹莓对松材线虫的成虫以及虫卵都具有良好的抑制和毒杀作用。

表5 两种植物萃取物对松材线虫虫卵孵化的影响(10 g/L)

3 讨 论

20世纪90年代以来，国内学者对我国具有杀虫活性的植物进行大范围的筛选，李雪娇[19]完成了203种植物的筛选工作，发现了有28种植物具有毒杀作用；张兴等[20]初选475种植物进行研究，发现了128种活性较好的植物，其中包括大戟(Euphorbiapekinensis)、百花蒿(Stilpnolepiscentiflora)、紫穗槐(Amorphafruticosa)、苦豆子(Sophoraalopecuroides)等50多种植物具有较好毒杀活性。丁伟等[21]从14种中草药植物中筛选出巴豆(Crotontiglium)、紫荆(CercisBunge)、乌头(Aonitumcarmichaeli)、姜黄(Curcumalonga)、金钱松(Pseudolarixamabilis)具有杀虫效果，且已有一部分被应用到杀虫剂开发中。国内学者[22-23]研究的生物农药源植物，主要集中于楝科(Meliaceae)、菊科(Asteraceae)、豆科(Leguminosae)、唇形科(Lamiaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、樟科(Lauraceae)、柏科(Cupressaceae)等。全球有5%～15%的植物已被进行了筛选，其中具有毒杀作用的植物有1 000多种。本研究即从上述文献中选取了具有代表性的30种植物及其供试部位进行杀线活性研究，寻找出更有杀线活性的植物源，为后续深入研究提供候选资源[4-14]。

本研究通过测定30种植物提取物对松材线虫的毒杀效果，结果表明喜旱莲子草和乌蔹莓乙醇提取物对松材线虫有强烈的毒杀活性。通过对提取物进一步萃取分离，发现喜旱莲子草乙酸乙酯萃取物和乌蔹莓水层萃取物对松材线虫的活性最高，且随着质量浓度的增加和处理时间的延长，杀线活性增强。这两种植物萃取物对松材线虫的毒杀作用强烈且作用持续时间较长，处理72 h 后松材线虫的LC50分别为 0.588 8和0.969 3 g/L，其中喜旱莲子草的乙酸乙酯萃取物对线虫的孵化抑制率为79.77%。表明喜旱莲子草乙酸乙酯萃取物和乌蔹莓水层萃取物存在能毒杀松材线虫的有效物质，且杀线虫活性成分的代谢半衰期较长，这为进一步从植物中分离杀线活性物质提供科学依据。

喜旱莲子草作为一种全球性恶性入侵种，近年来在我国迅速蔓延，造成了航运阻塞、传播寄生虫病、农作物减产及养护草坪难等危害[24]。随着对该植物种认识的深入，有关于其资源化利用的研究逐渐得到科研工作者的重视，将其作为植物源农药就是利用途径之一[25]。据报道，喜旱莲子草对小菜蛾(Plutellaxylostella)的触杀和胃毒毒力均较强，其石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水层萃取物对斜纹夜蛾(Spodopteralitura)和小菜蛾均具有忌避作用和毒杀作用，正丁醇层对小麦纹枯菌(Rhizotoniacerealis)、水稻纹枯菌(Rhizoctoniasolani)、番茄枯萎菌(Fusariumoxysporum)和玉米小斑菌(Bipolarismaydis)具有良好的抑制效果[26]。杨建明等[27]发现喜旱莲子草茎和叶的水提液对钉螺(Oncomelaniahupensis)有速杀效果，且浓度越高，效果显现越迅速。乌蔹莓在我国资源丰富，繁殖力很强，主要功效有：消肿解毒，清热利湿[28]。其提取物对大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等均有抗菌效应[29]。已发现乌蔹莓地上部分精油对赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)和玉米象(Sitophiluszeamais)具有很强的毒杀活性，并通过气相色谱技术和气质联用技术共鉴定出37种精油成分[30]。

目前鲜见喜旱莲子草、乌蔹莓提取物毒杀松材线虫的报道。从经济角度看，市面上喜旱莲子草的平均价格为0.006元/g，乌蔹莓平均价格为0.024元/g，两种植物购买成本远低于其他可以杀线的中草药植物价格，且喜旱莲子草和乌蔹莓繁殖快，一年四季均可采收，其他商用价值较少，用作杀线植物更加合理。若喜旱莲子草和乌蔹莓作为杀线植物研究其活性，将大大拓展其发展空间，为天然产物农药的研究提供新材料。故采用喜旱莲子草和乌蔹莓提取物开展防治松材线虫病的研究，提高了两种植物的应用价值，也为松材线虫病防治研究提供了新的思路。