壮药金母颗粒对盆腔炎性疾病后遗症大鼠的抗炎作用

蒋雅娴， 王志萍*， 陈 俊， 黎 芳， 李晓霞， 苏佳昇

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530001；2.广西高校中药制剂共性技术研发重点实验室，广西 南宁 530001)

盆腔炎性疾病后遗症是指女性上生殖道的一组感染性疾病，常为急性盆腔炎没有得到彻底治疗而引发的疾病[1]，症状为白带异常、腹痛，其主要病理机制为炎症反应。IL-10主要抑制炎症反应，促进组织的修复和再生，具有减轻炎症细胞过度活化状态的作用[2]。TLR4通路在介导炎症反应过程中起关键作用，TLR可能是细菌感染与炎症形成的桥梁，细菌性病原体与TLR4结合，激活TLR4/MyD88/NF-κB信号通路调控下游炎性介质，参与盆腔炎大鼠炎症进程[3]。研究发现，抑制TLR4通路可获得较好的抗炎效果[4]，如TLR4抑制剂能改善慢性盆腔炎大鼠病理形态学[5]。

在壮医临床实践中，“咪花肠”疾病中月经病、白带病的症状与盆腔炎性疾病后遗症相同。壮药金母颗粒由金刚刺、火炭母、土茯苓、虎杖、白背叶根、大血藤、苦参、梨头草、黄柏组成，治疗白带病效果好。其原方(妇雅净颗粒)能够干预盆腔炎性疾病后遗症大鼠NF-κB信号通路，起到改善盆腔炎性疾病后遗症的作用[6]，但对于壮药金母颗粒的抗炎作用未见报道。本研究通过检测壮药金母颗粒对盆腔炎性疾病后遗症大鼠子宫组织TLR4/MyD88/NF-κB通路表达的影响，探讨壮药金母颗粒发挥抗盆腔炎性疾病后遗症的作用机制，为治疗盆腔炎性疾病后遗症的药物开发提供参考。

1 材料

1.1 动物 SPF级SD雌性大鼠70只，体质量(200±20)g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(湘)2019-0002。饲养于广西中医药大学动物房，饲养环境温度为(23±2)℃，相对湿度为40%～60%，12 h/12 h明暗交替。实验前适应性喂养7 d，自由进食饮水。

1.2 试剂与药物 壮药金母颗粒(广西高校中药制剂共性技术重点实验室研制，每1 g颗粒相当于3.63 g生药，批号G20190601)；花红颗粒(广西壮族自治区花红药业集团股份公司，批号20180403)；复方醋酸地塞米松片(广东南国药业有限公司，批号171202)。RIPA细胞裂解液(北京索莱宝科技有限公司，批号R0020)；大鼠IL-1β、IL-10试剂盒(武汉华联科生物技术有限公司，批号RA20020-S、RA20090)；总RNA试剂提取盒(美国Promega公司，批号LS1040)；cDNA第一条链合成试剂盒康为试剂(北京康为世纪生物科技有限公司，批号CW2582M)；ECL发光试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号sc-2048)；TLR4抗体(北京博奥森生物技术有限公司，批号bs20595R)；NF-κB p65抗体(美国Affinity公司，批号AF5006)；MyD88抗体(武汉博士德生物工程有限公司，批号BA2321)。混合菌液由广西中医药大学微生物与免疫实验中心提供。

1.3 仪器 低温高速离心机、蛋白浓度定量仪(德国Eppendorf公司)；全波长扫描酶标仪(上海天能科技有限公司)；PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；超低温冰箱(日本三洋电机株式会社)；电热恒温箱(上海精宏实验设备有限公司)；全电脑自动组织脱水机、全自动组织包埋机、漂烘处理仪(常州市华利电子有限责任公司)；恒温培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)；石蜡切片机(上海创迅医疗器械有限公司)；正置荧光数码成像显微镜(日本Olympus公司)；电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；半干转膜仪系统(美国ATTO公司)；涡旋振荡仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

2 方法

2.1 分组、造模与给药 将70只大鼠随机分为空白组，模型组，花红颗粒组(2.70 g/kg)，醋酸地塞米松组(0.135×10-3g/kg)，壮药金母颗粒高、中、低剂量组(5.40、2.70、1.35 g/kg)，每组10只。造模前24 h禁食不禁水，模型组与各给药组大鼠次日腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)进行麻醉，剪去下腹正中部的毛，使皮肤暴露，用碘伏、医用酒精消毒后于下腹正中切1小口(0.8～1 cm)，开腹后使子宫暴露并固定，用磨去针头尖的4号针头在子宫分叉处分别朝两侧子宫方向进针，并于子宫宫腔内往返抽拉2次，注射1.5×108/mL细菌混悬液0.1 mL，分离肌肉层和皮肤层，缝合腹部，消毒手术区；空白组大鼠不做任何处理，手术后恢复饮水，正常饲养，用碘伏消毒手术区7 d。造模后第15天，各给药组大鼠灌胃给予相应药物，模型组与空白组大鼠灌胃给予等体积纯净水，剂量为10 mL/kg，每天1次，连续14 d。

2.2 ELISA法检测大鼠血清IL-1β、IL-10水平 给药14 d后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血后进行解剖。血液室温静置2 h，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上清，分装保存于-80 ℃。按照ELISA试剂盒说明书，检测大鼠血清IL-1β、IL-10水平。

2.3 子宫组织病理检测 剪取一半大鼠子宫，用4%多聚甲醛固定，经脱水、透化、石蜡包埋后，制备2～3 μm组织切片，HE染色后用中性树胶进行封片，在光镜下(×100)观察切片，根据表1对子宫病理形态变化进行分级。

表1 分级标准

2.4 RT-qPCR法检测大鼠子宫组织TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA表达 取大鼠子宫组织30～100 mg，按照总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，再按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录cDNA合成，配制所需的反应液，反应条件为25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。使用Real-time PCR仪进行扩增，反应条件为95 ℃预变性15 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火、延伸30 s，共40个循环。反应结束后进行熔解曲线分析，以β-actin为内参，采用2-△△CT法计算目的基因的相对表达。引物序列见表2。

表2 引物序列

2.5 Western blot检测大鼠子宫组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达 取适量大鼠子宫组织，剪碎后置于离心管中，加入RIPA裂解液提取蛋白质，用BCA法检测蛋白质浓度，加入4倍量蛋白质上样缓冲液，95 ℃变性10 min。各组取等量蛋白，10% SDS-PAGE凝胶电泳分离，250 mA恒流转移到PVDF膜，封闭液中室温封闭2 h，加入一抗工作液4 ℃孵育过夜，加入二抗(1∶3 000)室温孵育90 min，ECL试剂盒发光显影。采用凝胶成像分析系统扫描，检测各目的蛋白及内参蛋白β-actin条带灰度值，计算目的蛋白相对表达。

3 结果

3.1 壮药金母颗粒对盆腔炎性疾病后遗症大鼠子宫病理形态的影响

3.1.1 宫腔黏连与扩张病理评分 与空白组比较，模型组大鼠宫腔黏连与扩张评分升高(P<0.01)；与模型组比较，壮药金母颗粒高剂量组和醋酸地塞米松组大鼠宫腔黏连与扩张评分降低(P<0.05)，其余各给药组大鼠宫腔黏连与扩张评分差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 壮药金母颗粒对盆腔炎性疾病后遗症大鼠宫腔黏连与扩张情况的影响(n=10)

3.1.2 内膜充血水肿病理评分 与空白组比较，模型组大鼠子宫内膜充血水肿评分升高(P<0.01)；与模型组比较，壮药金母颗粒高剂量组和醋酸地塞米松组大鼠子宫内膜充血水肿评分降低(P<0.01)，其余各给药组大鼠子宫内膜充血水肿评分差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

3.1.3 上皮细胞增生病理评分 与空白组比较，模型组大鼠子宫上皮细胞增生评分升高(P<0.01)；与模型组比较，壮药金母颗粒高剂量组、花红颗粒组和醋酸地塞米松组大鼠子宫上皮细胞增生评分降低(P<0.05，P<0.01)，见表5。

表4 壮药金母颗粒对盆腔炎性疾病后遗症大鼠子宫内膜充血水肿情况的影响(n=10)

表5 壮药金母颗粒对盆腔炎性疾病后遗症大鼠子宫上皮细胞增生情况的影响(n=10)

3.1.4 子宫组织病理形态学 空白组大鼠子宫宫腔结构层次基本清晰，子宫内膜上皮完整，无充血、红肿现象；模型组大鼠主要病变为子宫宫腔粘连或扩张，内膜充血水肿，上皮细胞增生呈分支乳头状，伴有一定程度炎症细胞浸润等病变，基本符合临床盆腔炎性疾病后遗症病变特征；壮药金母颗粒高剂量组和醋酸地塞米松组大鼠子宫宫腔结构层次基本清晰，内膜上皮完整，偶可见宫腔粘连或扩张<1/3或上皮细胞呈高柱状、固有膜轻微充血水肿；花红颗粒组大鼠子宫组织轻微扩张但未见粘连，内膜局部充血红肿，但能改善上皮细胞增生情况；壮药金母颗粒中、低剂量组大鼠宫腔粘连或扩张1/3～2/3，个别有明显充血水肿，上皮细胞呈高柱状，见图1。

3.2 壮药金母颗粒对盆腔炎性疾病后遗症大鼠血清IL-1β、IL-10水平的影响 与空白组比较，模型组大鼠血清IL-1β水平升高(P<0.01)，IL-10水平降低(P<0.05)；与模型组比较，壮药金母颗粒高、中剂量组，花红颗粒组和醋酸地塞米松组大鼠血清IL-1β水平降低(P<0.05)，壮药金母颗粒高剂量组和醋酸地塞米松组大鼠血清IL-10水平升高(P<0.05)，见表6。

表6 壮药金母颗粒对盆腔炎性疾病后遗症大鼠血清IL-1β、IL-10水平的影响

3.3 壮药金母颗粒对盆腔炎性疾病后遗症大鼠子宫组织TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA表达的影响 与空白组比较，模型组大鼠子宫组织TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA表达升高(P<0.01)；与模型组比较，各给药组大鼠子宫组织中TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA表达均降低(P<0.01)，见表7。

表7 壮药金母颗粒对盆腔炎性疾病后遗症大鼠子宫组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表达的影响

3.4 壮药金母颗粒对盆腔炎性疾病后遗症大鼠子宫组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组大鼠子宫组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达升高(P<0.01)；与模型组比较，各给药组大鼠子宫组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达均降低(P<0.01)，见表8、图2。

表8 壮药金母颗粒对盆腔炎性疾病后遗症大鼠子宫组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达的影响

4 讨论

盆腔炎性疾病后遗症病名在古籍中没有记载，根据其症状，中医认为该病属于带下病、痛经、癥瘕、经病疼痛、经不调、妇人腹痛、不孕症等病症范畴[7]，而壮医认为其属于“月经病”“带下病”[8]，病机是由于湿热下注而使带下量多，热毒积蒸、损伤龙路，湿毒积结、淤阻花肠，故小腹疼痛、腰骶痠痛[9]，治则清热毒，除湿毒。又因积湿化热，湿热积结于火路，日久生虫，虫毒侵蚀阴部则痒痛不宁，龙路、火路失调，花肠功能失调，故使带下量多，色黄如脓、稠粘臭秽。湿热浸渍，则阴部瘙痒，甚则灼痛，治则以清热解毒祛湿、补花肠、杀虫止痒、调理三道二路。壮药金母颗粒是由课题组前期研制的获得专利授权的新制剂改良而来，由金刚刺、火炭母等组成，具有清热毒、除湿毒、灭虫毒、止瘙痒、消肿痛等功效。

Toll样受体4(TLR4)/髓样分化因子88(MyD88)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路在免疫及炎症机制中发挥作用[10]。TLR4为跨膜蛋白，是Toll样受体家族成员之一。外源性配体主要是病原体相关分子如细菌性病原体、真菌性病原体等[11-12]，与TLR4结合，引起炎症瀑布反应。白细胞介素(如IL-1β、IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等与TLR4结合，胞外炎性信号呈递给胞内MyD88[13],募集转导分子发生级联反应，磷酸化IKβ激酶(IKK)复合物(如IKKα、IKKβ、IKKγ)将IκB磷酸化，NF-κB与IκB解离，活化并进入细胞核与下游基因上的特定位点结合，启动并调控下游基因的转录，合成并释放细胞因子(如IL-1β、IL-2，IL-6、TNF-α等)[14-15]。细胞因子又通过正反馈调节激活炎症NF-κB通路[16]，加重炎症反应。多种抑制该信号通路的抗炎药均能起到较好的抗炎效果[17]，以TLR4/MyD88/NF-κB为靶标，将成为治疗盆腔炎性疾病后遗症的新思路。

本研究运用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的混合菌液加机械损伤法建立盆腔炎性疾病后遗症大鼠模型。结果显示，与空白组比较，模型组大鼠子宫病理组织评分升高，符合临床盆腔炎性疾病后遗症病变特征，证明造模成功[5]。模型组大鼠TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA及蛋白表达升高，提示TLR4、MyD88、NF-κB p65被活化，诱导炎性因子的转录，产生炎症效应，增加活化的NF-κB p65能促进下游IL-1β炎症因子的合成与分泌。与模型组比较，壮药金母颗粒高剂量组大鼠子宫病理组织评分降低，证实其可以抑制盆腔炎性疾病后遗症的炎症反应。壮药金母颗粒各剂量组大鼠组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA及蛋白表达降低，提示壮药金母颗粒可通过抑制TLR4、MyD88、NF-κB p65的表达，减少下游IL-1β炎症因子的合成与分泌。IL-1β作为TLR4/MyD88/NF-κB通路下游的炎症因子，高、中剂量壮药金母颗粒对其有抑制效果，但低剂量抑制效果不明显。IL-10是促进组织修复和再生的因子，而盆腔炎性疾病后遗症是需要较长时间形成的慢性炎症，修复组织是需要漫长的过程，因此，壮药金母颗粒对IL-10水平的影响敏感度不高，可能该通路是通过影响其他炎症因子起到抗炎作用的，有待开展进一步研究。

综上所述，壮药金母颗粒能够抑制盆腔炎性疾病后遗症大鼠的炎症反应，其机制可能是通过调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的传导而实现的。