间充质干细胞发挥抗菌作用的机制研究进展

李晓奇，王凤武，韩健健

（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；2.通辽市动物疫病预防控制中心，内蒙古 通辽 028000）

抗菌药物耐药性 （antimicrobial resistance，AMR） 是当今社会受到广泛关注的公共卫生安全问题。 AMR 是由抗菌药物滥用或低剂量持续使用引起的［1］。 近几年，美国兽医协会、欧洲兽医联合会发布了关于合理使用抗菌药物的联合声明以及兽用抗菌剂使用指南。此外，世界各地的许多机构正在努力减少抗菌药物的总体使用量。 研发和设计替代抗生素的生物制剂治疗病原微生物感染是当前临床的迫切需要。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在再生医学中被作为工程组织的原材料或作为治疗炎症疾病的免疫调节剂［2］。最近研究表明，MSCs已显示出作为解决AMR 的问题的潜力。 MSCs 具有抗菌特性， 能够分泌与病原体直接作用的抗菌分子以及增强宿主免疫细胞抗菌活性的因子［3-4］。研究证明，MSCs 与现有的抗菌药物治疗方法显示出强大的协同作用，可以作为抗菌、抗病毒及抗寄生虫药物的替代物。MSCs 在体外和体内均表现出一定的抗菌作用。 因供体物种和目标细菌种类不同，关于MSCs 的抗菌作用，研究文献中涉及许多不同的机制［5］。 此外， 其他因素会进一步影响MSCs 表型。 研究人员采用多种预处理方法，包括缺氧、血清剥夺和暴露于拮抗物质，以提高MSCs分化或调节免疫细胞的能力。 目前研究主要通过MSCs 接触细胞因子、目标细菌、细菌成分、维生素和抗菌药物探究其促进抗菌活性的条件， 从而改善其直接和间接的抗菌效果［6］。如果MSCs 的抗菌特性可以转化为可行的治疗选择， 它们就可以取代目前用于动物的大部分抗菌药物。笔者对MSCs影响细菌存活的作用机制以及抗菌药物可能对MSCs 功能产生的影响等方面的研究进展进行综述，以期为进一步阐明MSCs 抗菌作用机制、挖掘MSCs 作为治疗细菌感染性疾病新方法的潜力提供参考。

1 MSCs 抗菌作用的直接机制

1.1 MSCs 分泌抗菌肽发挥抗菌作用

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是MSCs发挥抗菌功效的关键组成部分。AMPs 是成簇共表达的短氨基酸链，对细菌、酵母菌、真菌和癌细胞具有天然防御功能。 目前存在超过1 200 种已知的AMPs， 它们由从原核生物到高等动物的生物体产生。 AMPs 主要通过破坏微生物细胞膜杀灭微生物。此外，AMPs 还能调节宿主先天免疫细胞功能， 对微生物入侵进行防御。 已鉴定出几种AMPs 由MSCs分泌，主要有导管素（cathelicidins）、β-防御素（β-defensin）、 脂质运载蛋白2 （lipocalin2） 以及吲哚胺2，3-双加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）。

导管素是一个主要的AMPs 家族， 在先天免疫中具有突出的作用。 导管素会导致细菌细胞膜破坏和细胞裂解［7］。导管素LL-37 与MSCs 对细菌的直接杀伤作用有关［8］。LL-37 具有杀菌特性以及在脓毒症模型中降低细胞因子和内毒素水平的能力。 研究显示LL-37 对体内外MSCs 抗菌活性至关重要。 进一步研究发现， 脂肪来源的MSCs 的LL-37 活性依赖于1，25-二羟基VD3。在标准培养条件下，相对于MSCs，1，25-二羟基VD3补充剂增强了LL-37 的产生， 而用VD 受体抑制剂处理会使抗菌反应无效。 同种异体小鼠MSCs 的体内研究也表明导管素是杀死细菌的关键AMPs 之一［9］。导管素通过TLR2/4-IRAK4 依赖性途径起作用，以建立有效杀死分枝杆菌的方法［10］，但是，结核分枝杆菌已经产生一种生存机制， 可以通过下调CAMP 基因表达破坏该途径， 并抑制骨髓来源MSCs 的抗菌作用。

β-防御素是富含半胱氨酸的阳离子蛋白，大小从18 到145 个氨基酸不等。这些分子在细菌细胞膜中形成孔，导致细菌裂解［11］。 在人源MSCs 的研究中并不总是能够检测到β-防御素。 研究发现，MSCs 暴露于铜绿假单胞菌、 金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌后不存在β-防御素2 或β-防御素3，所有杀菌作用归因于LL-37 的释放。相反，Sung等［12］在铜绿假单胞菌刺激和未刺激的MSCs 中鉴定出了人类β-防御素2。其他研究人员通过TLR-4 信号传导从人源MSCs 中发现β-防御素分泌是大肠杆菌暴露后旁分泌体外抗菌作用的关键机制。 研究还显示在小鼠模型中经大肠杆菌处理的MSCs 可分泌类似的β-防御素。在奶牛中，除NK-赖氨酸外，β-防御素4A（bBD-4A）的AMPs 相关基因（NK1）表达在胎儿MSCs 中被发现，但未发现导管素2、铁调素和IDO 的基因表达［13］。 MSCs 与金黄色葡萄球菌共培养增加了bBD-4A 和NK1 基因表达。

脂质运载蛋白2 是一种AMPs，通过螯合含铁载体发挥作用，剥夺细菌的铁质并限制其生长。在革兰阴性细菌性肺炎小鼠模型体内， 脂质运载蛋白获得高表达。 当脂质运载蛋白2 被阻断时，MSCs 的细菌清除作用消失。脂质运载蛋白2 的表达可以通过利用LPS 和TNFα 激活MSCs 而上调。研究发现LPS 刺激可导致MSCs 中脂质运载蛋白2 的表达增加［14］。 虽然AMPs 对MSCs 发挥抗菌作用很重要，但它们并不是唯一起作用的机制。

MSCs 中IDO 的表达参与对细菌的反应。 IDO的作用是降低局部色氨酸水平， 从而诱导广谱抗菌活性。 经炎性细胞因子TNFα、IL1β 和IFNγ 刺激的MSCs，其IDO 表达上调，导致细菌生长减少。单独使用TNFα 或IL1β 刺激MSCs 未能限制细菌生长，但2 种细胞因子都上调了IFNγ 介导的IDO活性。值得注意的是，添加IDO 抑制剂或色氨酸恢复了细菌的生长， 证实了IDO 是MSCs 发挥抗菌作用的关键机制。 体内研究尚未发现小鼠MSCs的IDO 表达。 由于缺乏IDO，鼠类MSCs 无法抑制金黄色葡萄球菌的细胞外生长， 但可有效抑制金黄色葡萄球菌的细胞内生长。 巨细胞病毒能够抑制IFN-γ 通路， 所以该病毒感染能够抑制MSCs对细菌和寄生虫的杀伤能力［15］。 另有研究发现，IDO 表达的上调可以通过暴露于TLR3 激动剂poly I:C 实现［16］。

1.2 MSCs 直接降解细菌生物膜提高抗菌药物的效果

生物膜是细菌产生的聚合物基质， 导致细菌对消毒剂、抗菌药物和免疫细胞的抵抗力增强。在临床上， 生物膜使细菌对抗菌药物的耐受性提高了100～1 000 倍。 最近研究表明，MSCs 具有分解生物膜的潜力。 MSCs 可通过降解生物膜层和增加抗菌药物渗透提高常规抗菌药物的功效。 Marx等［17］研究了MSCs 条件培养基对多种细菌的体外作用，发现铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生物膜形成和菌体生长受到抑制。 进一步研究表明， 在MSCs 条件培养基中检测到了半胱氨酸蛋白酶， 发现其通过减少细胞外蛋白质含量抑制生物膜形成， 并允许常规抗菌药物更好地渗透。 这些研究揭示了MSCs 与抗菌药物联合治疗细菌感染性疾病的潜力。

2 MSCs 抗菌作用的间接机制

2.1 MSCs 诱导巨噬细胞间接促进抗菌作用

MSCs 被证明具有通过旁分泌因子与宿主免疫系统相互作用的能力。 巨噬细胞是关键的免疫参与者，在组织修复、体内平衡维护和细菌自噬中发挥作用。 此外，巨噬细胞可被诱导为抗炎M2样表型或促炎M1 样表型。研究证实，受感染组织中激活的同种异体小鼠MSCs 具有诱导M2 样巨噬细胞的能力， 而未经处理的受感染组织具有M1 样显性巨噬细胞群。 对细菌的杀伤作用归因于MSCs 诱导M1 样巨噬细胞表型的能力。 未激活的MSCs 可诱导M1 样和M2 样巨噬细胞的混合群体。 未激活的人源MSCs 能够以同样的方式影响巨噬细胞表型， 在大鼠模型中诱导M2 样和M1 样巨噬细胞的混合群体。 MSCs 通过前列腺素E2（PGE2）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）对人巨噬细胞进行调节，加强其对细菌的有效吞噬作用［18］。研究发现，MSCs 与巨噬细胞接触可以优化线粒体转移， 尽管由于存在外泌体介导的线粒体转移， 但通过细胞松弛素B 阻断MSCs 间超细细胞质桥梁 （TNT） 的形成并没有完全消除线粒体转移。体内研究发现，TNT 形成是MSCs 发挥抗菌功效所必需的，这意味着细胞接触依赖性转移是巨噬细胞极化的关键。 在使用人源MSCs 的啮齿类动物模型中观察到类似的结果，MSCs 增强了巨噬细胞对大肠杆菌的吞噬作用，并且添加内毒素和TNFα 后巨噬细胞的吞噬活性进一步增强。Lee等［19］提出了另一种巨噬细胞刺激机制：在离体肺模型的单核细胞中发现同种异体人源MSCs 将角质形成细胞生长因子（KGF）释放到人单核细胞的KGF 受体上，从而增强细菌清除能力，并减少细胞凋亡。 其他研究确定了体外MSCs 释放的高水平趋化因子CCL2 会诱导炎症单核细胞的募集。 与未激活的MSCs 相比， 经poly I:C 激活的MSCs 释放了更高水平的CCL2。

2.2 MSCs 分泌细胞因子增强免疫细胞功能

研究发现，MSCs 通过分泌IL-6、IL-8 和MIF细胞因子增强多形核中性粒细胞（PMN）对细菌的摄取。这些分子与中性粒细胞上的受体CXCR1 和CXCR2 结合，介导PMN 的募集和激活。 中性粒细胞还会产生中性粒细胞胞外陷阱（NET），这有助于防止细菌传播和介导杀伤作用。 Chow 等［20］将未激活的或小鼠模型中的MSCs 与对照中性粒细胞相比，发现与经poly I:C 激活的人源MSCs 条件培养基共孵育后，每个细胞产生的NET 面积增加。

2.3 MSCs 增强其他免疫细胞免疫调节特性

MSCs 已被证明可以增强其他免疫细胞的免疫调节特性。 经牙龈卟啉单胞菌总蛋白提取物（PgPE）刺激的人牙周膜衍生MSCs（PDLSCs）能够分泌炎症标志物和趋化因子， 包括RANTES、eotaxin、IFNγ、诱导蛋白10（IP-10）、IL-6、IL-8 和白细胞介素受体拮抗剂蛋白（IL-1ra）［21］。通过上述研究得出结论，PDLSCs 是将免疫细胞募集到受感染组织的关键因素， 而未受刺激的MSCs 分泌的趋化因子水平可忽略。MSCs 暴露于鼠伤寒沙门菌和嗜酸乳杆菌也可导致免疫调节基因COX2、IL-6和IL-8 转录水平提高以及PGE2分泌增加。 除了表达AMPs，研究人员还发现感染细菌后，MSCs 中的免疫调节基因MCP-1、IL-6、IL-8 和CCL5 表达上调， 表明免疫细胞募集和激活是MSCs 杀灭微生物的机制。 研究进一步发现，MSCs 在暴露于米诺环素后，其免疫调节活性增加。米诺环素能诱导人源MSCs 中核转录因子-κB（NF-κB）的磷酸化，导致LL-37 含量减少、IL-6 含量增加、 金黄色葡萄球菌负荷总体净减少。

3 抗菌药物对MSCs 功能的影响

3.1 抗菌药物对MSCs 具有抑制作用

抗菌药物不仅在临床医学中用于治疗细菌感染性疾病， 还用于预防细胞培养过程中可能出现的微生物污染。 抗菌药物可以在培养过程中对MSCs 产生影响， 甚至在使用抗菌药物治疗后对局部组织细胞也有影响。因此，MSCs 对细菌感染性疾病的治疗效果可能会受到一些抗菌药物的影响。研究发现， 不同类别的抗菌药物对不同来源的MSCs有显著影响。科研人员对氨基糖苷类药物是否对干细胞的生长具有负面作用进行了研究。当以剂量依赖性方式与庆大霉素一起培养时，人源MSCs 的成骨和软骨形成显著减少；当药物浓度大于2 000 μg/mL 时， 在被其他氨基糖苷类药物处理的成骨细胞中也观察到了这一点， 例如妥布霉素和阿米卡星。在马源MSCs 中，庆大霉素对体外细胞活力没有影响，但在较高浓度（500 μg/mL）时降低了总RNA 水平，即蛋白质表达受到了不同程度的抑制。在同一研究中，氟喹诺酮类药物（如恩诺沙星）也导致MSCs活力和总RNA 水平显著降低。 两性霉素等抗生素会在培养24 h 内影响MSCs 的生长和分化［22］，在使用氯霉素时也观察到了这种情况。

3.2 抗菌药物对MSCs 具有促分化作用

尽管许多抗菌药物对MSCs 具有抑制作用，但也有一些抗菌药物可以增强MSCs 分化。 四环素类药物， 如强力霉素， 被证明可以增强人源MSCs 的软骨形成和分化，这在体内研究中得到了进一步证实。此外，土霉素可促进前软骨细胞系中的软骨分化，以剂量依赖性方式促进软骨形成。杆菌肽等多肽类抗生素以剂量依赖性方式增强人源MSCs 的成骨分化， 并上调成骨基因表达水平［23］。与对照和经青霉素—链霉素处理的MSCs 相比，经两性霉素B（AmB）和AmB-Cu 处理的MSCs 在存在成骨诱导因子（包括地塞米松、β-甘油磷酸和抗坏血酸）的情况下成骨。

3.3 抗菌药物对MSCs 免疫调节作用的影响

抗菌药物也被证明有可能诱导MSCs 的免疫调节作用。 在经米诺环素处理的人源MSCs 中观察到了这一点，这种效应在后期开展的一项体内研究中也得到证实。 在大鼠伤口模型中，与单独使用水凝胶相比，载有米诺环素的水凝胶增强了培养体系中人源MSCs 的伤口愈合表型。 500 μg/mL 以上的头孢噻呋等头孢菌素类抗菌药物会导致MSCs 的总RNA 减少，提示毒性作用。 在同一项研究中，不同浓度的青霉素总体上对MSCs 没有显著影响。

青霉素—链霉素的组合经常用于细胞培养以避免污染，包括旨在研究MSCs 抗菌作用的试验。尽管假设二者对细胞的影响可以忽略不计， 但已证明青霉素—链霉素会导致细胞基因表达、 细胞调节和细胞生长速率发生显著变化。 这种影响可以直接干扰细胞对体外不同刺激的反应， 从而影响试验结果［24］。

4 小结与展望

在原理验证研究和小型临床案例研究中，MSCs 在治疗感染性疾病方面显示出一定的潜在功效，因此，有必要进一步挖掘利用MSCs 替代或改善当前抗菌药物疗法的潜力。MSCs 通过多种机制发挥抗菌作用，包括分泌AMPs、提升宿主免疫系统功能和促进免疫细胞直接吞噬作用。MSCs 可以成为一种临床上重要的广谱抗菌剂， 能够单独有效地控制多重耐药（MDR）菌株引起的感染，或者更有可能与常规抗菌药物联合使用。MSCs 有可能减少动物抗菌药物的使用量并降低动物源细菌耐药性的产生和扩散，这对人类健康也很重要。由于兽医领域关于MSCs 的研究才刚刚出现， 还有许多研究问题需要解决。