精准基因编辑技术的研究进展

张赟，徐澍

(江苏省肿瘤发生与干预重点实验室，江苏 南京 210009)

0 引言

自2012年起，CRISPR/Cas9基因组编辑系统被首次发现之后，国内外的研究者一直致力于对CRISPR/Cas9的优化升级，分子生物学和医学领域发生了革命性的变化。通过不断的探索实践，想要获得一种更精准、更方便和更经济的基因组编辑工

具[1,2]。

CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作基础原理是，Cas9蛋白在向导RNA的引导下对靶DNA进行双链断裂[3]，接着通过细胞内自发的同源重组修复机制(HDR)或非同源重组修复机制(NHDR)进行修复，从而实现了对靶点基因序列的插入或删除(indels)[4]。但是，CRISPR/Cas9依赖的HDR及NHDR仅限在细胞中存在，限制了其作用范围；并且这种修复对靶基因引入随机的插入和缺失(indels)[5]不受控制，带有不确定性，而大约67%的人类遗传疾病及动植物性状区分遗传片段都是由单核苷酸变异(SNP)引起的[6]，于是精准的单碱基校正技术便在这些迫切需求下诞生了[7,8]。

相较于CRISPR/Cas9的非精准编辑[9]，单碱基编辑技术BE和先导编辑器PE的作用更精准[10]。BE可在不产生DNA双链断裂，也没有供体DNA提供的情况下，即可实现单个碱基的替换，相较于CRISPR/Cas9不仅减少了一些副作用而且简化了整个编辑过程[11]。PE是CRISPR基因组编辑工程的最新成员，在CRISPR/Cas9系统的基础上，通过对小分子sgRNA以及蛋白酶的改造，可在细胞水平实现任意编辑[12]。BE和PE作为新型治疗工具，在纠正人类基因组致病突变方面具有显著的潜力，大约超过25%的人类致病位点能被纠正。下面将对这几种精准编辑系统进行介绍。

1 单碱基编辑技术

1.1 胞嘧啶碱基编辑器

胞嘧啶碱基编辑器(CBE)主要是由sgRNA、dCas9(Cas9蛋白发生突变而失去了切割DNA的功能)或nCas9(D10A)(Cas9蛋白发生突变后只能切割单链DNA)、尿嘧啶糖基化酶抑制子以及胞嘧啶脱氨酶构成[13]。其工作原理是，sgRNA先通过碱基互补配对原则与靶点结合，然后引使复合蛋白结合到达靶位点。在复合蛋白中的胞嘧啶脱氨酶的脱氨基作用下，非互补链中相应的C被作用后改为U，而互补链中与编辑链上C互补的鸟嘌呤G由于碱基互补配对改成与U互补的腺嘌呤A，在尿嘧啶糖基化酶抑制子的作用下，减少了尿嘧啶U的切除事件的发生，最后便实现了非互补链上的C被替换成T，以及互补链上的G被替换成A的精准编辑[14]。

2016年，哈佛大学博德研究所的刘如谦团队建立了三种rAPOBEC1碱基编辑器(大鼠胞嘧啶脱氨酶组成了复合蛋白)[10]。rAPOBEC1与dCas9组成了第一代碱基编辑器CBE1，在体外试管水平实现了C与T之间的替换编辑，尽管CBE1在引导高效的靶向碱基编辑在体外编辑效率高达37%，但它在哺乳动物细胞体内的编辑效率却很低，作者认为这种效率的降低很大程度上归因于细胞通过碱基切除修复(BER)途径修复DNA时产生的U-G中间体。U-G中间体由尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil N-glycosylate，UNG)启动的，UNG识别U-G失配，切断尿嘧啶和DNA脱氧核糖主链之间的糖苷键，导致碱基编辑器产生的U-G中间体逆转回C-G碱基对而导致编辑产物毫无变化。

针对CBE1碱基编辑器的低编辑效率和局限性，刘如谦团队想要通过抑制尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)来提高编辑效率，于是在CBE1的基础上，将尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)融合到CBE1的C端，来抑制UNG的活性，开发了第二代胞嘧啶碱基编辑器(CBE2)[11]。实验结果显示在人类细胞中编辑效率相较于CBE1提高了三倍。之后该团队又在CBE2的基础上把毫无切割活性的dCas9替换成了nCas9(D10A)形成CBE3，在哺乳动物细胞体内自发的错配修复机制作用下，对靶点处进行修复编辑，进而便可提高碱基编辑效率，这一次对CBE的升级也使CBE3的编辑效率比CBE2提高了6倍[11]。

1.2 腺嘌呤碱基编辑器

腺嘌呤碱基编辑器(ABE)是由Cas9蛋白与腺嘌呤脱氨酶构成，在sgRNA的介导下靶向靶点后，通过腺嘌呤脱氨酶的脱氨基作用把A变成肌苷I，而肌苷在DNA水平会被当做G进行识别和复制，于是达到了将A替换成G的目的[8]。

目前存在的腺嘌呤脱氨酶在行使脱氨基作用时不能把DNA作为底物，刘如谦团队通过对大肠杆菌来源的tRNA腺苷脱氨酶TadA和人类来源的腺苷脱氨酶ADAT等多种腺嘌呤脱氨酶与nCas9融合后均未发现编辑活性，于是刘如谦就对腺嘌呤脱氨酶进行替换改变，把随机突变TadA序列的大肠杆菌的TadA与nCas9融合，构建了一个突变蛋白文库，先通过对氯霉素，卡那霉素，大观霉素的抗性恢复的筛选，最后得到了能作用于DNA的ABE单碱基编辑系统，后来经过不断的改进，由刘如谦开发的第7代腺嘌呤碱基编辑器通过实验显示在哺乳动物细胞中的编辑效率约为50%，并且引入插入或缺失的频率低于0.1%[8]。此外，最近的研究报告了用于人类细胞编辑的双碱基编辑器系统，这些新的碱基编辑器扩大了DNA碱基编辑器的范围，使其能够进行转位突变，并且可能比目前单一的DNA碱基编辑器能够实现更复杂的复合编辑[15]。

1.3 单碱基编辑器的应用

研究人员先在植物中进行单碱基编辑实验。高彩霞的研究团队[12]学习应用了单碱基编辑技术，在小麦，玉米和水稻中进行育种编辑，即构成了植物单碱基编辑系统(nCas9-PBE)，通过实验也证明了能在植物基因组中进行高效准确的单碱基编辑，编辑效率最高可达43.48%。

接着开始考虑将单碱基编辑器应用到哺乳动物体内。根据统计，大概有75000个人类基因组位点和遗传疾病有关。而真正有确切临床治疗手段的遗传疾病还不足6%。目前，单碱基水平突变导致的基因疾病占了大多数。对哺乳动物来说，由于单碱基编辑器具有将胞嘧啶(C)转化为胸腺嘧啶(T)的能力，所以可以使其成为一种治疗方法，通过针对性地纠正单个碱基的突变来应用在各种基因疾病模型中。比如β地中海贫血和镰状细胞病，前者是因为β-珠蛋白基因的第7个密码子发生了点突变。而后者是因为珠蛋白基因(hemoglobinbeta, HBB)变异而发病，主要原因是HBB基因上发生了A-G的突变。而它们导致血液疾病的发生均是由于血红蛋白的β基因的缺陷。中山大学的黄军就教授研究团队[16]通过对不能发育成熟的人三原核胚胎细胞和患者早期皮肤细胞使用了CBE3编辑系统，对其基因组进行单碱基修复编辑，效率分别为40.9%和20%。为传统疗法无法治疗的遗传疾病提供了希望。由于APOE4基因的突变会诱发迟发型阿尔兹海默疾病，刘如谦研究团队利用BE系统在鼠星型胶质细胞纠正了APOE4的突变，编辑效率高达70.4%[14]。另外，Chadwick团队的研究人员首先在小鼠身上建立了人高脂血疾病模型，由于PCSK9基因突变的人不易得高脂血症，通过CBE3对PCSK9基因进行突变，便可达到降低血浆胆固醇的水平的目的[17]。通过上述例子，也说明单碱基编辑技术有望成为人类基因组疾病治疗的手段。

2 Prime Editing

现有的另外一种精准编辑工具，是由刘如谦实验室开发的可对靶位点任意编辑的新工具Prime Editor(PE)[18]。PE是以CRISPR/Cas9系统为基础，首先在sgRNA的3’端增加一段RNA序列成为pegRNA(pegRNA上携带着引物结合位点和逆转录的模板序列)，然后将逆转录酶M-MLV和Cas9切口酶(H840A突变型，只切断以含PAM的靶点DNA链)融合，通过Cas9切口酶的作用切开单链，pegRNA末端的模板序列可以作为DNA修复的模板，在逆转录酶的作用下按照既定的模板编辑靶点DNA。依据PE的工作原理，可以实现对A-T，A-G，A-C，T-G，T-C，G-C等共12种单碱基间的自由相互转换，还能实现多碱基的精准插入和删除，适当弥补了BE系统的不足。

刘如谦团队通过对逆转录酶进行点突变，进化后得到了第二代PE2(D200N + L603W + T330P + T306K + W313F)[18]。与PE1相比，PE2的点突变效率和碱基的插入删除效率提高了近2倍。但作者认为编辑效率还不够高，假设如果能对两条链都进行修正的话，那么效率将会大大提高。于是便设计了一条靶向另一条链的sgRNA，构建了PE3，可以实现切割非互补链的目的来提高编辑效率。在293T细胞中也证明了PE3系统的编辑效率可以达到78%。但由于产生了双链断裂，Indels的风险也大大增加，作者进一步在PE3的基础上改进，构建了PE3b，设计了一条靶向pegRNA编辑产物的sgRNA，融合蛋白便可以先后单链切割靶基因来进行双链编辑，在不产生双链断裂的基础上也大大提高了编辑效率[18]。

目前科学家们已经在动物上成功应用了精准编辑技术，刘如谦实验室在患有遗传性耳聋的小鼠中进行了实验，通过将碱基编辑器注入小鼠的内耳中后部分恢复了小鼠的听力[19]。2021年底，刘如谦团队对PE进行改进成Twin prime editing(twinPE)，是通过两个pegRNA在基因组的特定位置进行切割，后引入更大的DNA序列。作者先对一种罕见的人类遗传疾病亨廷顿综合征进行实验，这种遗传疾病的产生是由于长度约4000 bp的DNA片段倒位导致的。他利用twinPE技术成功纠正了疾病序列错误。解决了第一代PE的一个缺陷，即最多只能编辑几十个碱基对[20]。但是PE的应用仍处于起步阶段，随着技术的发展，PE技术有待作为一种新的遗传疾病治疗方式，能够更安全，更有特异性地治疗疾病。未来再更新的精准编辑器应该在体内实验中提供更高的效率和低indel形成[21]。无论如何，PE系统是精准基因编辑通用方法发展过程中一个巨大的里程碑，在纠正已知致病突变的临床疾病方面已经展现出来无限的潜力。

3 结语

短短的9年时间里，基因组编辑技术取得了飞跃进展，由最先的对目标基因随机打靶到现在可以实现对基因任意碱基的精准替换编辑，技术上已经实现了很多重大突破。但是在编辑效率和脱靶等问题上，仍然有发展空间。并且精准编辑技术对于动植物基因功能研究[22]、基因治疗[23]和分子育种[24-25]等许多方面都有着重要的研究应用价值，所以我们迫切需要大力发展这项技术。但同时也有很多问题不可忽略。

首先，如何有效地递送碱基编辑器是一个有待解决的难题，开发一种安全高效的传递系统对于精准编辑技术在临床中的成功应用至关重要。药物一般都是由小分子化合物制成不同剂型，可以通过口服，注射，透皮等方式进行递送。但基因编辑器是一个复杂的复合大分子，基因编辑器在体内如何被有效地递送到相关的组织器官的部分靶位点，对于它们的药效发挥至关重要。目前通过利用自然界的病毒装载碱基编辑器来递送至人体是已经成功实践了的、非常有前景的递送手段。来自马赛诸塞大学的研究者Guangping Gao开发出了一种依赖于病毒外壳递送的新方法[26]，其编辑效率更高，而脱靶效应更低。通过将基因编辑器装入腺相关病毒等病毒中，然后可以感染人体内的细胞并释放基因编辑器，得以成功递送。但是病毒载体对传输物质大小有限制，由于AAV的血清型都已普遍研究，且具有有限的免疫原性，AAV已成为基因组编辑器传递的普遍使用方式。如果将Cas9与胞嘧啶脱氨酶、UGI、sgRNA装载入AAV载体进而递送BE系统，它们的组成序列很长，高达4.7kb，AAV载体无法对BE系统进行完全包装[26]。此外，研究发现，如果在基因编辑传送系统中使用脂质纳米颗粒也许会展现出意想不到的结果[27]。一些研究者使用脂质纳米颗粒，在电场作用下将基因编辑器带到细胞中，来达到递送目的[28]。尽管已有很多种递送方式，但免疫原性仍是不可忽略的问题，也是大多数递送方式需要改进的一点。

然后，我们通过利用基因编辑技术，为遗传性疾病、肿瘤等多种疾病解决了很多难题。但是社会各界对于直接在人类胚胎细胞中进行编辑方面仍然存在争议。首先，对早期胚胎细胞时期发生基因突变进行编辑，可治疗一些传统治疗方法无法根本治疗的疾病。其次，基因编辑技术无法避免的一个缺陷，就是可能会有控制不了的脱靶，或者错误编辑时间的发生，从而导致严重的后遗效应，这些将严重影响到人类的生活生存。然而目前很多国家对基因编辑治疗的监管措施立法上仍然有很多不足，如何合理地对待及管理基因编辑技术仍旧是一大难题。

总而言之，精准编辑技术已经在人类疾病治疗等领域中表现出了巨大的潜力，随着生物技术时代的发展，越来越多的蛋白及其功能将被发现，通过更多学科的知识融合，新一代的精准编辑技术将会更加简单高效。随着人们对疾病深度认识，特别是对那些传统疗法难以治愈的遗传疾病，精准编辑技术的临床疾病应用研究将有非常大的发展空间，而它的进步也势必会极大推动全世界生命科学，生物医药领域的发展。