顺阿曲库铵通过调控miR-3666表达抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭

周霞 刘德智 孟瑞霞 王培山

(新乡市中心医院 1麻醉与围术期医学科，河南 新乡 453000；2 RICU)

膀胱癌(BCa)是泌尿系最常见的恶性肿瘤之一，手术是其主要治疗方式，但其具有极高的复发率，导致患者预后不良〔1,2〕。相关研究〔3〕指出麻醉方式和麻醉药物会影响肿瘤患者术后的转移与复发。阐述麻醉药物、技术对术后肿瘤转移及复发的影响，可为临床麻醉策略提供参考〔4〕。顺阿曲库铵是阿曲库胺的同分异构体之一，一种新型强效中时效非去极化型肌松药，可安全用于临床麻醉〔5〕。研究报道顺阿曲库铵通过改变p53依赖的凋亡途径，在体外有效抑制结直肠癌HCT116细胞的增殖并诱导其凋亡〔6〕。顺阿曲库铵可抑制食管鳞状细胞癌细胞上皮间质转化(EMT)，抑制细胞的侵袭、迁移及增殖，并促进其凋亡〔7〕。然而顺阿曲库铵对膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响及机制还尚未清楚。研究表明，miRNA可以作为癌基因或抑癌基因在膀胱癌中发挥作用〔8〕。miR-3666在胃癌患者中低表达，参与胃癌的淋巴结转移，会引起胃癌患者预后不良〔9〕。circ_0018069通过携带包括miR-3666在内的多种miRNA形成黏着信号通路，在膀胱癌中发挥抗癌作用〔10〕。miR-3666通过靶向溴区PHD结构域转录因子(BPTF)抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭性〔11〕。miR-3666通过靶向特殊富含AT序列结合蛋白(SATB)2抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭〔12〕。而miR-3666对膀胱癌细胞及顺阿曲库铵是否通过调控miR-3666影响膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭目前未知。本实验旨在研究顺阿曲库铵可能通过调控miR-3666对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1材料 胎牛血清、RPMI1640培养基购自武汉益普生物；膀胱癌细胞株T24购自上海北诺生物；MTT试剂盒由上海谷研生产；RIPA蛋白裂解液、二辛可宁酸(BCA)试剂盒由深圳子科生物生产；苯磺顺阿曲库铵由江苏恒瑞医药生产；Transwell小室、基质胶由美国BD公司生产；RT-qPCR试剂盒由北京麦瑞博生物生产。

1.2细胞处理与分组方法 将膀胱癌细胞T24培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，取对数期细胞。用顺阿曲库铵分组，分别采用10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L 顺阿曲库铵处理，分为顺阿曲库铵低(Cis-L组)、中(Cis-M组)及高浓度(Cis-H组)组，并将正常培养细胞记作Con组。用miR-NC、miR-3666转染T24细胞分组，分为miR-NC组和miR-3666组。用anti-miR-NC、anti-miR-3666转染T24细胞分组，用40 μmol/L 顺阿曲库铵处理，分为Cis+anti-miR-NC组和Cis+anti-miR-3666组。

1.3MTT检测细胞增殖抑制率 将细胞培养24 h，在每孔中加入20 μl的MTT并孵育4 h，再在每孔中加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，然后用酶标仪于波长490 nm处检测吸光度(OD)值，最后得出细胞增殖抑制率。

1.4Transwell检测细胞迁移和侵袭实验

1.4.1迁移实验方法 细胞调整密度为5×105个/ml，上室加100 μl悬浮液，下室加600 μl培养液，培养24 h，采用多聚甲醛固定30 min后，使用结晶紫进行30 min染色，然后用倒置显微镜拍照和观察，最后计算细胞迁移数。

1.4.2侵袭实验方法 T小室的上室加入适量基质胶，按上述方法操作，最后计算细胞侵袭数。

1.5Western印迹检测蛋白表达方式 首先收集细胞提取总蛋白并定量煮沸变性。其次行电泳，转膜后用5%脱脂奶粉封闭，加一抗4℃孵育过夜。最后加入二抗室温孵育2 h，使用电化学发光(ECL)显影，成像后检测蛋白条带的灰度值。

1.6RT-qPCR检测miR-3666表达 各组细胞培养48 h后提取细胞总RNA，合成cDNA，并以U6为内参行PCR扩增，相对表达量采用2-△△Ct法进行计算。miR-3666上游引物5′-AACGAGACGACGACAGAC-3′，下游5′-CAGTGCAAGTGTAGATGCCGA-3′；U6上游引物5′-AACGAGACGACGACAGAC-3′，下游5′-GCAAATTCGTGAAGCGTTCCATA-3′。

1.7统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1顺阿曲库铵对膀胱癌T24细胞增殖的影响 与Con组比较，Cis-L、M、H组细胞增殖抑制率、p21表达水平显著升高，细胞周期蛋白(Cyclin)D1表达水平显著降低(P<0.05)。见图1，表1。

图1 各组增殖相关蛋白表达

表1 顺阿曲库铵对膀胱癌T24细胞增殖及CyclinD1、p21蛋白表达的影响

2.2顺阿曲库铵对膀胱癌T24细胞迁移、侵袭的影响 与Con组比较，Ois-L、M、H组细胞迁移、侵袭、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表达水平显著降低(P<0.05)。见图2，表2。

表2 顺阿曲库铵对膀胱癌T24细胞迁移、侵袭的影响

2.3顺阿曲库铵对膀胱癌T24细胞中miR-3666表达的影响 与Con组(1.00±0.06)比较，Cis-L、M、H组miR-3666表达水平显著升高(1.64±0.18、2.25±0.24、3.07±0.21；F=203.625，P<0.001)。

2.4过表达miR-3666对膀胱癌T24细胞增殖、迁移和侵袭的影响 miR-3666组miR-3666表达水平、细胞增殖抑制率、p21表达水平均显著高于miR-NC组，miR-3666组细胞迁移、侵袭细胞数及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平显著低于miR-NC组(P<0.05)。见图3，表3。

图3 增殖、迁移、侵袭相关蛋白表达

表3 miR-3666过表达对膀胱癌T24细胞增殖、迁移及侵袭的影响

2.5抑制miR-3666表达逆转顺阿曲库铵(40 μmol/L)对膀胱癌T24细胞增殖、迁移和侵袭的作用 与Cis+anti-miR-NC组比较，Cis+anti-miR-3666组miR-3666表达水平、细胞增殖抑制率、p21表达水平显著降低，细胞迁移、侵袭细胞数及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平显著升高(P<0.05)。见表4，图4。

表4 抑制miR-3666表达逆转了顺阿曲库铵对膀胱癌T24细胞增殖、迁移和侵袭的作用

1，2：Cis+anti-miR-NC组，Cis+anti-miR-3666组

3 讨 论

膀胱癌是我国泌尿系统恶性肿瘤中发病率最高的肿瘤，且其复发率及死亡率也较高〔13,14〕。研究显示，顺阿曲库铵抑制结直肠癌细胞增殖和转移〔15〕。顺式阿曲库胺可抑制肺癌细胞A549和肝癌HepG2细胞增殖和转移，促进凋亡〔16〕。本实验用不同浓度顺式阿曲库胺处理膀胱癌细胞T24，结果显示，顺式阿曲库胺可剂量依赖性的抑制膀胱癌细胞T24增殖、迁移和侵袭。且顺式阿曲库胺降低了CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平，提高了p21表达水平。CyclinD1、p21是细胞周期相关蛋白，其异常表达可影响细胞增殖〔17,18〕。MMP-2、MMP-9通过降低细胞外基质可促进细胞迁移、侵袭〔19〕。本研究结果表明，顺式阿曲库胺抑制膀胱癌细胞T24增殖、迁移和侵袭的作用可能与细胞增殖、迁移、侵袭相关蛋白表达水平有关。

miRNA是一类小的非编码RNA， miRNA在调节癌症发展和转移有关的基因中具有重要作用〔20〕。已有研究报道miR-3666参与调控多种肿瘤的恶性生物学行为，如宫颈癌组织中miR-3666水平显著降低，垂体瘤转化基因(PTTG)1调控miR-3666介导的锌指结构E-box结合蛋白(ZEB)1可增强宫颈癌细胞侵袭能力〔21〕。miR-3666通过靶向赖氨酸脱甲基酶(KDM)2A抑制胶质母细胞瘤细胞的生长和迁移〔22〕。miR-3666过表达显著抑制甲状腺癌细胞的生长〔23〕。miR-3666过表达通过靶向沉默寡糖蛋白(SIRT)7抑制乳腺癌细胞的增殖，促进细胞凋亡〔24〕。miR-3666还可通过靶向SIRT7促进促凋亡信号通路进而抑制非小细胞肺癌细胞生长〔25〕。以上研究表明miR-3666可通过靶向调控其靶基因影响多种肿瘤的进展。而本实验发现，miR-3666过表达可抑制膀胱癌细胞T24增殖、迁移和侵袭，miR-3666在膀胱癌中的作用与在其他癌症中作用相似。

本实验用不同浓度的顺式阿曲库胺处理膀胱癌细胞T24后，miR-3666表达水平呈剂量依赖性升高。将miR-3666抑制剂转染至T24细胞后用顺式阿曲库胺处理，结果显示，细胞增殖抑制率降低，细胞迁移、侵袭升高。表明抑制miR-3666表达逆转了顺阿曲库铵对膀胱癌T24细胞增殖、迁移和侵袭的作用。