m6A甲基化在胶质瘤中的研究进展*

苑铮博 综述，李承龙，李泽福 审校

(滨州医学院附属医院神经外科，山东 滨州 256603)

胶质瘤是一种常见于成人的侵袭性星形胶质细胞恶性肿瘤。根据世界卫生组织(WHO)的分类，胶质瘤分为4级，其中1级和2级胶质瘤被定义为低级别胶质瘤，而3级和4级胶质瘤被定义为高级别胶质瘤[1]。恶行程度最高的胶质瘤亦称作Ⅳ级胶质母细胞瘤(GBM)[2]。目前，最大限度地切除肿瘤和术后分次放射是治疗胶质瘤的标准方案[3]，患者中位生存期为12～15个月[4]，26.5%的患者可存活2年。胶质瘤浸润性的特性决定手术不能完全切除所有肿瘤组织[5]，由肿瘤残留物引起的复发会在术后不久发生[6]。尽管手术切除、辅助放射治疗和替莫唑胺(TMZ)化疗仍是主要的治疗策略，但基于肿瘤的固有免疫和干细胞特性的个体化治疗可能会使患者获得生存益处。

一般认为，胶质瘤的主要发病机制包括重要原癌基因的激活、抑癌基因的失活和分子网络的失衡[7]。尽管对胶质瘤的研究在神经肿瘤学领域取得了重大进步，但胶质瘤患者的预后仍不容乐观,不同级别的胶质瘤之间的预后差异也不尽相同。RNA甲基化是一种表观遗传修饰，类似于DNA甲基化和组蛋白修饰。N6-甲基腺苷(m6A)甲基化是RNA甲基化中最常见、研究最深入的一种，其存在于整个RNA生命周期中，通过影响RNA代谢发挥生物学功能[8]。到目前为止，几乎170种类型的RNA修饰已经被鉴定出来，并在全球范围内被称为“表位转录组”[9]，其中m6A是真核生物中最常见的类型[10]。越来越多的研究表明，RNA代谢的各个方面都有m6A的参与，包括mRNA的剪接，3′末端加工，核酸的清除与输出，翻译调控，mRNA衰变和非编码RNA加工[11]。20世纪70年代的开创性研究证实了mRNA中存在m6A，但直到近几年才意识到mRNA中的m6A的生理作用[12]。而m6A RNA甲基化调节剂通过调控靶基因，进而调控胶质瘤细胞的生长、进展和侵袭，这为m6A调节靶轴作为胶质瘤新的治疗靶点和临床预后指标提供了可靠依据[13]。目前，有研究利用肿瘤基因组图谱(TCGA)和中国胶质瘤基因组图谱(CGGA)数据，系统评价多个m6A RNA甲基化调节因子在胶质瘤中的表达谱和预后意义，对m6A甲基化在胶质瘤中的作用进行了更深入的研究。但胶质瘤中的m6A甲基化的功能仍有待确定，更好地理解胶质瘤进展背后的m6A RNA甲基化机制，对于开发新的治疗方法至关重要。本文就m6A甲基化在胶质瘤发展、诊断及治疗方面的作用进行了综述。

1 m6A监管机构

目的基因上的m6A RNA甲基化由含有甲基转移酶样蛋白(METTL)3、METTL14、Wilms瘤1相关蛋白(WTAP)、METTL16、ZCCHC4和KIAA1429等的甲基转移酶复合体(识别蛋白)安装，并由脂肪与肥胖相关基因(FTO)和烷基化修复蛋白B同源物5(ALKBH5)组成的去甲基化酶(擦除蛋白)去除。m6A修饰目标的功能是由m6A结合蛋白(读写蛋白)通过直接或间接与m6A结合来完成的，包括YTH m6A RNA结合蛋白、YTH结构域蛋白、胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白(IGF2BP)和异质性细胞核核糖蛋白(HNRNP)家族[14]。这些读写蛋白、擦除蛋白和识别蛋白作为m6a RNA甲基化的调节因子，可在不同水平上影响靶基因的mRNA，包括转录、翻译、剪接、稳定和凋亡[15-17]。

1.1甲基转移酶复合体 其核心成分是由METTL3-METTL14异源二聚体形成，靶向与RNA49-5结合[18]。文献证据表明，METTL3是限速酶，而METTL14是m6A甲基化过程的支架[19]。其中，METTL3是复合体中的催化组分，需要结合的供体底物S-腺苷蛋氨酸在催化位点。而METTL14是m6A中的一种失活的甲基转移酶，其是METTL3酶活性的变构激活剂，有助于复合物的RNA结合[20]。在各种类型的细胞中单独敲除METTL3则可显著减少了m6A修饰，随后会对细胞存活、干细胞维持和谱系确定产生巨大影响[21-23]，这支持了METTL3可发挥独立于METTL14可用性的关键作用的事实。此外，WTAP是与METTL3和METTL14构成复合体的第三组分。WTAP的一个主要功能是将METTL3及其结合伙伴METTL14定位于核斑点[24]。WTAP的耗尽会导致METTL3和METTL14在这些斑点上的定位丢失，并导致mRNA中m6A形成的丢失。因此，WTAP在斑点中维持METTL3的存在，从而有效地进行甲基化mRNA[25]。

1.2去甲基化酶 擦除蛋白包括FTO和ALKBH5[26]。m6A甲基化的逆转是由被称为FTO的去甲基化酶和ALKBH5催化的[27]。m6A去甲基化酶“FTO”和后来的ALKBH5的发现，鼓励了m6A是通过主动去甲基化在细胞内或跨条件动态调节的假设。这2种去甲基化酶被称为m6A“擦除蛋白”，是确保转录组中m6A修饰的平衡蛋白。2001年，有研究小组首次证实，在DNA或RNA的修饰过程中，FTO蛋白是一种非常重要的去甲基化酶[25]，其在RNA的m6A甲基化中的作用是不可忽视的。ZHANG等[28]研究发现，ALKBH5在胶质瘤干细胞(GSC)中高表达。抑制ALKBH5可显著降低复发的GBM来源的GSC11、GSC17和GSC23的成瘤率，降低巢蛋白和赋予肿瘤细胞自我更新能力的核心转录因子SOX2、Nanog、Oct4的表达，提示ALKBH5对GSC自我更新的产生影响。然而，有研究显示，m6A可能不是FTO的生理相关靶点[29-30]。在生化分析中直接测试时，N6,2′-O-二甲基腺苷(m6Am)的脱甲基化速率比m6A高100倍，这是关于FTO功能的研究进展[30]。FTO优先介导m6Am的去甲基化，而不是m6A的去甲基化[31]。提示FTO和ALKBH5在胶质瘤中可能优先介导不同甲基化靶点的去甲基化。此外，ZHANG的[32]研究指出，抑制FTO可通过靶向MYC-miR-155/23a簇-MXI1反馈通路，进而增强TMZ的抗肿瘤作用，其具体机制是FTO通过MYC调节整个信号通路。该研究还证实FTO参与了MYC基因介导的miR-155和miR-23a簇的促进，从而增强了胶质瘤细胞的恶性特性。

1.3结合蛋白 m6A影响mRNAs命运的一个主要机制是招募m6A结合蛋白以反式方式介导RNA功能，称为m6A结合蛋白[33]。最早发现和表征的阅读器蛋白家族之一是YTH结构域蛋白家族，其中RECHAVI等最初在m6A RNA下拉实验中确定YTHDF2和YTHDF3是m6A结合蛋白[10]。含有YTH结构域的蛋白通过调节RNA的剪接、翻译、定位和寿命广泛地参与转录后调控。哺乳动物基因组中有5种含YTH结构域的蛋白，主要分为：YTHDC1、YTHDC2和YTHDF蛋白家族。YTHDC1是细胞核中唯一已知的m6A阅读器，也是唯一被证明在胶质瘤中具有生物学意义的调节因子，这一功能的执行取决于YTHDC1与RNA结合的能力[34]。据报道，YTHDC1参与了剪接过程中的外显子选择、表观遗传沉默及mRNA的核输出[35]。与其他无处不在表达的YTH蛋白不同，YTHDC2在睾丸中富集，是一种假定的RNA解旋酶，其与减数分裂特异的螺旋卷曲结构域蛋白形成复合物，调节减数分裂过程中的RNA水平，促进翻译[36]。

2 m6A甲基化与胶质瘤

2.1m6A甲基化与胶质瘤的增殖、迁移及侵袭 有研究表明，m6a调节剂与胶质瘤的进展和预后有关[37]。北京天坛医院的一项研究通过对CGGA和TCGA数据库进行单变量和多变量Cox回归分析发现，由m6A RNA甲基化调节因子得出的风险评分可独立预测胶质瘤患者预后[37]。LI等[38]通过下调METTL3或上调FTO来降低m6A水平，观察到U251细胞的迁移和增殖显著增强。这一结果被细胞迁移和CKK-8实验所证实。用同样的方法，该研究团队检测了m6A水平升高的U251细胞的迁移和增殖，结果与预测相同。随着m6A细胞的增多，凋亡细胞明显增多，反之亦然。该研究团队还证实了低m6A水平的U251细胞增殖增强的主要原因可能是细胞凋亡减少。为了证实m6A与HSP90的关系，该研究团队检测了过表达METTL3的U251细胞中HSP90的水平，并与对照细胞进行了比较。在体外，较低的m6A甲基化水平可减少U251细胞的凋亡，促进U251细胞的增殖，提高m6A水平可以挽救U251细胞的增殖。

有研究者通过分析METTL3对U87细胞的影响来探索其在胶质瘤增殖、侵袭以及迁移中的作用。JI等[39]研究发现，METTL3的上调抑制了U87和LN229细胞的增殖，而促进了细胞的凋亡。该研究团体进行了创口愈合和跨孔侵袭实验，结果显示，METTL3的下调增强了U87和LN229细胞的迁移和侵袭，与此相反，在U87和LN229细胞中过表达METTL3。同样，通过伤口愈合和跨孔侵袭实验检测METTL3的迁移和侵袭能力，其中创口愈合实验结果表明，METTL3过表达抑制了U87和LN229细胞的迁移。此外，该研究团队还发现，METTL3过表达也降低了U87和LN229细胞的侵袭能力。METTL3基因下调促进了胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制了胶质瘤细胞的凋亡。此外，LI等[40]研究指出，Notch信号通路(包括关键基因METTL3、DLL3、HES1和NOTCH3)与肿瘤的发生和发展密切相关。随后，同济大学的CONG等[13]利用相关分析探讨了Notch信号通路在GBM和低级别胶质瘤中的潜在调控相互作用，并且发现METTL3与胶质瘤中DLL3、HES1和NOTCH3的表达呈正相关，特别是在GBM的mRNA和蛋白水平上发现的这种相关性。这支持了之前学者的观察结果，即沉默METTL3可降低GBM干细胞系中DLL3、HES1和NOTCH3的转录和蛋白水平，并增加细胞凋亡。最终，CONG等[13]的研究证明了METTL3可通过调控其直接靶点NOTCH3、DLL3和HES1来激活Notch通路，促进胶质瘤的发生，Notch通路基因可能成为胶质瘤的潜在治疗靶点。但有趣的是，CHAI等[37]通过利用CGGA(n=309)和TCGA(n=595)的RNA测序数据进行分析时发现，METTL3和METTL14的表达与胶质瘤的WHO分级无关。

除了METTL3与胶质瘤之间的联系逐步被研究发现以外。在2012年时，JIN等[23]研究首次指出，WTAP在GBM中过表达。此外，该研究还发现WTAP调控GBM细胞的迁移和侵袭。SiRNA的特异性敲除或cDNA的过度表达调控癌细胞的迁移和侵袭。在异种移植研究中，WTAP过表达使癌细胞更具致瘤性。在对其内在机制的研究中发现，WTAP过表达通过表皮生长因子受体(EGFR)刺激促进GBM细胞的迁移和侵袭能力。XI等[41]研究发现，WTAP受QKI-6调控。WTAP mRNA在其3′UTR区含有一个称为QKI反应元件的特定序列，QKI-6由此诱导WTAP表达。虽然还需要进一步的研究来充分阐明WTAP在GBM的发病机制中的作用机制，但有理由认为WTAP向特定的未知靶点增强甲基转移酶的活性促进了GBM的进展，利用基于miRNA的某种治疗方法可能对胶质瘤的治疗是有益的。此后，另一个m6A识别蛋白家族也逐渐走进人们的视野——IGF2BP家族，包括IGF2BP1/2/3，其可以抑制m6A修饰的转录本的降解并促进其翻译[42]。WANG等[43]首次发现，miR-873直接靶向m6A的读取的蛋白IGF2BP1，并通过其3β-UTR的第一结合位点下调IGF2BP1在GBM细胞中的表达。同时，该研究发现miR-873的异位表达明显抑制GBM细胞的增殖和侵袭，这种表型是通过miR-873/IGF2BP1信号通路介导的。此外，YANG等[44]研究发现，MIR-138通过负性调控IGF2BP2，抑制低级别胶质瘤细胞的生长、转移和上皮细胞间质转化过程。同样地，MU等[45]研究发现，抑制IGF2BP2使GBM对TMZ治疗敏感。

XIAO等[46]研究阐明了一个MYC-miRNA-MXI1反馈环，其可调节胶质瘤的增殖和肿瘤发生。MYC通过microRNA-155(miR-155)和microRNA-23a-27a-24-2簇(miR-23a簇)抑制MXI1的表达，而MXI1则通过与其启动子结合而抑制MYC的表达。MiR-155和miR-23a簇的过表达促进了U87胶质瘤细胞的成瘤。此外，FTO是一种m6A RNA去甲基化酶，通过靶向MYC来调节环路。甲氯芬酸乙酯形式抑制FTO，增强化疗药物TMZ抑制胶质瘤细胞增殖的作用，并对环路进行负性调节。BHARGAVA等[47]的研究表明，IGF2mRNA结合蛋白3(IMP3)是一种GBM上调的RNA结合蛋白，可促进胶质瘤细胞的迁移。综合生物信息学分析表明，p65是核转录因子-κB异源二聚体的一个亚基，是IMP3促进胶质瘤细胞迁移的重要调节因子。IMP3增加了p65蛋白水平，但未改变p65转录本水平，且促进了其多聚体的结合。体外转录RNA的紫外光交联研究证实了IMP3与p65 3′UTR位点的特异性和直接结合。此外，IMP3可诱导携带野生型位点的p65 3′UTR报告基因的荧光素酶活性，但不能诱导突变位点的荧光素酶活性。在IMP3沉默条件下，3′UTR缺失的p65外源过表达挽救了胶质瘤细胞迁移减少的现象。此外，IMP3沉默抑制了胶质瘤干细胞的维持和迁移。

2.2m6A甲基化与胶质瘤的诊断、预后及治疗 早在2016年，有研究显示，WTAP的表达预示着恶性胶质瘤患者的不良预后，WTAP在胶质瘤组织中高表达，且与胶质瘤分级密切相关，尤其是在GBM中的过渡表达，且在生存期短的患者中，WTAP的高表达与预后不良之间存在统计学趋势[48]。提示WTAP可能作为胶质瘤的一种新的预后标记物，并可以为治疗提供更多的选择。最近的研究表明，m6A RNA甲基化调节因子的转录水平与胶质瘤的预后密切相关，并指出YTHDF1与胶质瘤的进展有关，YTHDF1的高表达也预示着胶质瘤患者的不良预后[49]。XU等[49]开发了一个标准图来预测胶质瘤患者总存活率，并发现hsa-mir-346是YTHDF1表达的上游调控因子，可能参与了减少胶质瘤发展的新疗法的开发。

为了研究m6A甲基化调节因子的预后价值，有学者采用套索Cox回归算法，根据HNRNPC、ZC3H13和YTHDF2的表达筛选出一个独立的预后风险特征，其中低危组与高危组的预后特征有显著差异，可预测预后意义[50]。该研究结果确定了m6A RNA甲基化调节剂在GBM和HNRNPC中的潜在功能、预后价值和表达特征，其可能与临床存活率、m6A甲基化水平和胶质瘤的恶性进展高度相关。提示HNRNPC有可能成为预测诊断和预后的一种新的治疗手段。一项观察性研究在了解m6A甲基化相关因子的表达是否可以用于胶质瘤的单纯预后判断时，将13个m6A甲基化调节剂的mRNA表达水平与胶质瘤的临床病理特征联系起来，结果显示，WTAP和甲基转移酶复合体的2个组成部分(擦除蛋白ALBKH5、读写蛋白YTHDF2)的表达与WHO分级之间呈正相关，而与擦除蛋白FTO的表达呈负相关[37]。上述研究未发现METTL3、METTL14或METTL16与mRNA的表达或WHO分级之间的相关性。

3 生物信息学分析

3.1m6A甲基化与低级别胶质瘤 已发表的文献在TCGA、CGGA和GTEx数据集中确定了36个具有可获得表达数据的m6A RNA甲基化调节子。ZHENG等[51]对这36个低级别胶质瘤中m6A RNA甲基化调节因子的表达谱进行分析时发现，大部分调节因子在低级别胶质瘤组织中的表达与正常脑组织和GBM组织存在差异。即使在WHO Ⅱ、Ⅲ级间，m6A RNA甲基化调节因子的表达水平也存在较大差异。m6A相关的预后信号包含9个m6A RNA甲基化调节子，其中7个是ZCCHC4、SETD2、IGF2BP2、IGF2BP3、YTHDF2、EIF3H和YTHDC1，另外2个分别是RBM15和ALKBH3。

3.2m6A甲基化与高级别胶质瘤 首先，脑组织中的m6A甲基化是高度特异的[10]。但在GBM中，m6A的状态可能有所不同。CGGA微阵列和RNA测序数据库中的生物信息学分析提示，与低级别胶质瘤相比，m6A识别蛋白WTAP和RBM15、m6A摘除蛋白ALKBH5和m6A读写蛋白YTHDF2显著升高，而m6A识别蛋白METTL3、Virma和ZC3H13、m6A摘除蛋白FTO、m6A识别蛋白YTHDC2和HNRNPC显著降低[52]。另一种生物信息学分析显示，WTAP、RBM15、YTHDF与ALBKH5的表达呈正相关，而FTO的表达与WHO分级呈负相关[37]。此外，ALKBH5、YTHDF2、RBM15、METTL3、METTL14、FTO和YTHDC1在有无突变异柠檬酸脱氢酶(IDH)的低级别胶质瘤中的表达水平有显著差异。此外，FTO、YTHDC1和METTL3在IDH突变的GBM和无IDH突变的GBM中也有差异表达。重要的是，胶质瘤恶性临床病理特征相关的m6A RNA甲基化调节因子的表达和胶质瘤的致癌基因密切相关。这些证据表明，m6A基因的修饰与GBM的进展密切相关。根据目前对GBM的研究，m6A修饰似乎起着关键作用，因为m6A读写蛋白和摘除蛋白都在GBM的发生中起着作用。

4 小结与展望

虽然近年来人们对mRNA m6A甲基化在癌症中的作用有了越来越多的了解，但一些重大的挑战仍然没有解决。大量研究表明，m6A调节子及其相关通路可作为治疗靶点，然而许多潜在作用尚不清楚。m6A水平及其调节因子能否作为潜在的肿瘤诊断和预后标志物，取决于其特异性和敏感性，这还需要进一步的研究。m6A甲基化在胶质瘤的增殖、迁移及侵袭方面具有重要作用，随着分子生物学技术的快速发展，特别是单细胞测序和第3代测序技术的发展，RNA甲基化修饰如何影响胶质瘤生物学行为的机制将逐渐明朗，这会为胶质瘤的早期诊断、组织学分级和靶向治疗提供了新见解。